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摘要：斑馬魚已被確定為醫學研究中最重要的模式生物之一。多項研究證明人類和斑馬魚基因組之間存在高度相似性，推薦使用斑馬魚作為了解人類遺傳疾病（包括癌癥）的模型。斑馬魚皮膚與人類皮膚有一些相似之處表明該模式生物特別適合研究腫瘤性和炎癥性皮膚病。本文評估了斑馬魚皮膚的具體特征，并描述了斑馬魚模型在皮膚病學研究中的主要應用。

簡介：動物模型系統提供了一種技術手段來進行人類受試者無法進行的研究，為理解人類生理學和病理生理學提供了寶貴的鑰匙。其不僅可以進行更先進的藥代動力學和藥效學研究還可以發現治療人類疾病的新方法。由于其與人類眾所周知的生理和遺傳相似性，小鼠和其他哺乳動物模型已被常規用于醫學研究。與傳統模型相比，其他動物模型顯示出明顯的優勢。近年來對該領域的興趣有所增加。魚類似乎是迄今為止研究的動物模型中最有趣的非哺乳動物脊椎動物模型，維護成本低且允許體內成像。Platyfish (Xiphophorus) 和 Medaka (Oryzias latipes) 已成功用作黑色素瘤模型。20世紀80年代初，Streisinger 及其同事首次引入斑馬魚模型進行遺傳研究。

斑馬魚是小型脊椎動物熱帶魚被用作反向和正向遺傳研究，其特點是維護成本低。斑馬魚被用作正向遺傳研究模型（通過觀察某種表型來識別特定基因型）。使用點突變進行正向遺傳篩選既耗時又費力。近年來越來越先進的技術已經克服了使用斑馬魚創建多種疾病模型的挑戰，并通過反向遺傳學（觀察已知基因型產生的表型）擴大了斑馬魚研究。超過 80% 的已知人類疾病基因包括癌基因和腫瘤抑制基因，斑馬魚都有其直系同源物。并且一些途徑也是保守的，即使是與致癌有關的途徑。所有這些特征和證據促進了斑馬魚作為理解人類遺傳疾病（包括癌癥）模型的使用并指出了其在體內篩選新療法的潛力對個性化醫療時代尤為重要。盡管小鼠模型仍然是醫學研究領域中最常用的模型，但斑馬魚具有小鼠模型所沒有的一些優勢和獨特特征。

斑馬魚皮膚：魚皮包括表皮、真皮和皮下組織類似于哺乳動物的皮膚。與表皮被角質化的死細胞外層覆蓋的哺乳動物和陸生脊椎動物的表皮不同，斑馬魚的皮膚表面沒有角質層是由被粘液覆蓋的活細胞組成。此外，斑馬魚沒有哺乳動物的皮膚附屬器，無法檢測到毛囊和皮脂腺。哺乳動物表皮是一種組織良好的分層組織，包括從基底膜到皮膚表面的基底細胞、棘細胞、顆粒細胞和角質細胞。 硬骨魚表皮只有三層，表層是單細胞層，其中細胞富含角蛋白絲，在死亡時不斷被替換不會產生角質層。中間層由不同的細胞類型組成，包括單細胞腺體（粘液細胞和棒狀細胞）、感覺細胞、離子細胞和未分化細胞。 基底層是一個單細胞層，通過半橋粒與基底膜相連，半橋粒將表皮與真皮緊密連接。

斑馬魚從胚胎成熟到完全發育的魚只需要幾天時間。 在受精后一天（dpf）已經可以檢測到代表表皮和真皮層。成年斑馬魚覆蓋表皮的鱗片在30 dpf左右形成，已經確定音猬因子途徑在其發育中起作用。膠原基質的形成依賴于成纖維細胞，而色素的產生來自黑素細胞，屬于神經嵴衍生的色素細胞系統。一些表皮標記基因，包括角蛋白 1 和 5、230 kDa 大皰性類天皰瘡抗原、plectin 和一些皮膚基底膜區（BMZ）基因，包括 IV、VII 和 XVII 型膠原蛋白，在斑馬魚皮膚的早期發育階段表達。大多數表達的I、V 和 VI人類膠原蛋白類型可在6 dpf斑馬魚皮膚中檢測到。與皮膚發育有關的斑馬魚基因庫與人類皮膚有很強的相似性。斑馬魚的神經嵴產生三種不同的色素細胞：黑素細胞、黃素細胞和虹彩細胞。黑素細胞合成黑色素，類似于脊椎動物的黑素細胞，黃素細胞含有蝶啶色素引起黃色外觀，虹彩細胞形成有反射光的虹彩外觀。受精后約24小時，來自神經嵴的黑素祖細胞首先在色素細胞中形成黑素小體。

圖1、斑馬魚和人類皮膚的比較。

與哺乳動物黑色素細胞一樣，酪氨酸蛋白激酶 KIT 在胚胎前兩天促進黑色素細胞的初始遷移方面發揮著重要作用。在斑馬魚幼蟲發育后期，一組新的黑素細胞有助于形成斑馬魚條紋特征。

斑馬魚皮膚炎癥：皮膚對于保護魚類免受環境應激因素至關重要。 由于魚是變溫動物，即使外部參數的微小變化也可能導致損傷和炎癥。一系列上皮細胞、常駐非免疫細胞、血管內皮細胞和粘膜上皮細胞有助于啟動和協調炎癥反應。有趣的是，與人類不同，魚沒有大量的淋巴積聚。目前尚不清楚魚皮膚的淋巴細胞存在于何處。 最可能的理論是魚類白細胞通過粘液分泌物遷移到皮膚以響應損傷刺激。炎癥通路在哺乳動物和魚類中均受 NF-κB 家族轉錄因子的調節，經典的促炎細胞因子如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 在大多數硬骨魚中占主導地位，因此這兩種動物的主要炎癥機制相似。中性粒細胞在啟動哺乳動物和斑馬魚的炎癥反應以及炎癥的發生中起著重要作用，尤其是通過 TNF-α 和 IL-1β。一旦被激活，單核細胞分化為典型的促炎巨噬細胞，作為抗原呈遞細胞發揮作用，并產生活性氧（ROS）、TNF-α和IL-1β。中性粒細胞活化決定了其顆粒的胞吐作用。 中性粒細胞也招募抗原呈遞細胞，例如樹突細胞、巨噬細胞和內皮細胞。雖然哺乳動物的白細胞起源于骨髓并在淋巴結中成熟，但斑馬魚缺乏這種結構。頭腎中有骨髓對應物，作為主要的造血和淋巴器官。事實上，魚類和哺乳動物共享胸腺、脾臟和粘膜相關淋巴組織（MALT）。利用熒光研究了斑馬魚皮膚中免疫細胞的遷移和增殖，誘導了與炎癥相關的皮膚基因的熒光早期表達。

斑馬魚腫瘤模型：腫瘤學領域的最大障礙之一是解決個體間差異或腫瘤內環境中的癌癥異質性。癌癥研究的創新很大程度上得益于在活體動物中進一步探索這些過程。通過大規模藥物（小分子）篩選，患者來源的癌細胞異種移植 (PDX) 可以幫助克服腫瘤細胞增加的突變而導致的治療耐藥性。這一過程在小鼠模型中不像魚類等非哺乳動物模型那樣容易實現因為小鼠PDX需要受體免疫抑制。與人類相比，斑馬魚的癌癥信號通路高度保守。斑馬魚是一種多功能模型，因為可以在特定基因中操作突變，從而產生穩定的轉基因，或產生特定基因的瞬時過表達或下調。 斑馬魚也可以進行正向和反向遺傳篩選。斑馬魚已被用于正向遺傳篩選，以測試誘變劑對腫瘤發育的影響。導致 tp53 突變的乙基亞硝基脲篩選是癌癥發病機制研究中最多的基因之一，是斑馬魚在腫瘤學領域的首批實驗之一。隨后引入了進一步的技術，這有助于斑馬魚的癌癥研究取得進展。目的是創建功能喪失表型或將通常在人類癌癥中發生突變的轉基因引入魚類模型。許多突變的腫瘤抑制基因，如Tp53，以及癌基因，如mMyc和KRas，可以在斑馬魚中產生與在人類身上觀察到的相同的平行腫瘤。揭示了人和魚之間腫瘤發生驅動因素和途徑的進化保守性。斑馬魚最常用的基因操縱技術是MOs、ZFN、TALENs和CRISPR。最近引入了新的有前途的技術用于斑馬魚，例如 TEAZ（成年斑馬魚的轉基因電穿孔）和腫瘤細胞移植，特別是 PDX 的形式。

斑馬魚黑色素瘤模型：自首次描述 BRAF V600E 模型以來，黑色素瘤無疑是斑馬魚中研究最多的癌癥和分析最多的皮膚癌之一。 在大約 43-50% 的黑色素瘤中發現V600E 突變，一種關鍵的黑色素瘤驅動因子也經常在不會進展為癌癥的良性痣和痣中發現。腫瘤抑制基因p53（p53?/?）的功能喪失是痣進展為癌癥所必需的。攜帶 BRAF V600E 和 p53-/- 突變的斑馬魚黑色素瘤形成時間長且罕見，這意味著還有其他分子改變和途徑在黑色素瘤形成中起作用。基于斑馬魚黑色素瘤中表達了通常僅限于發育中斑馬魚胚胎中的神經嵴祖細胞的crestin，進行了在crestin控制下表達GFP（綠色熒光蛋白）的轉基因斑馬魚的研究。GFP 陽性細胞表明，只有重新激活 crestin 的單個黑色素細胞才能引發黑色素瘤。與crestin表達一致的是SOX10轉錄因子的表達，SOX10是一種保守的早期神經嵴標記，有助于黑素細胞重新編程到胚胎狀態。神經嵴基因如 crestin（在斑馬魚黑色素瘤中）和 SOX10（在斑馬魚以及人類黑色素瘤細胞系中）的重新激活可能是組蛋白表觀遺傳修飾的結果。N-RAS 突變也在斑馬魚中進行了研究，其表達導致斑馬魚全身色素沉著過度。當 p53 突變被添加到突變的 N-RAS 中時，魚會產生侵襲性黑色素瘤，這些黑色素瘤在組織學和遺傳上與人類黑色素瘤相關。雖然黑色素瘤的發生率低于前面提到的 BRAF 和 N-RAS 突變，但 H-RAS 突變的斑馬魚模型也顯示出黑色素瘤的發展。

斑馬魚鱗狀細胞癌模型：盡管與黑色素瘤相比，魚類中的非黑色素瘤皮膚癌不太常見，但斑馬魚也已被充分用作研究此類癌癥潛在發病機制的模型。采用鱗狀細胞癌異種斑馬魚移植模型已經確定了參與鱗狀細胞瘤（SCC）發病機制的關鍵分子以及可能用作SCC治療靶點的化合物。作為治療靶點進行研究的關鍵分子是酪氨酸激酶受體 Axl，它在 SCC 中高度表達。其他重要的靶點是 COL7A1 基因，它負責在大皰性表皮松解癥中發展侵襲性 SCC以及重組VII型膠原（hrCol7），它能夠逆轉斑馬魚模型中的SCC血管生成。另一項有趣的體內異種移植模型研究分析了酪氨酸激酶盤狀結構域受體 2 (DDR2) 在頭頸部鱗狀細胞癌 (HNSCC) 細胞增殖、粘附、分化和侵襲中的作用。另一種治療HNSCC的潛在化合物是海洋微生物提取物luminacin。斑馬魚胚胎的研究表明luminacin治療腫瘤細胞刺激SCC細胞系的自噬從而抑制腫瘤生長和進展。斑馬魚模型也表明KB細胞中FLOTILIN-1的過度表達促進了KB細胞的運動和細胞生長。這些研究證明斑馬魚模型不僅可用于評估SCC發生和發展的分子途徑，還可用于藥物毒性和篩選試驗。

斑馬魚的其他皮膚病學應用：斑馬魚不僅可用于研究源自黑色素細胞的癌癥，還可以研究其他黑色素生成障礙，因為斑馬魚和哺乳動物之間的黑色素生成途徑是保守的。通過研究斑馬魚白化病模型可以闡明基因的功能，這些基因在這種疾病的發病機制中的作用可能尚未被認為與人類白化病有關。正確的基因診斷可能對治療不同但臨床上往往無法區分的白化病至關重要。基因功能的快速 CRISPR 篩選使斑馬魚成為發現白化病基因的絕佳模型。盡管違反直覺，斑馬魚白化模型也有助于闡明黑素瘤中癌性黑素細胞的化療耐藥機制。使用MOs研究遺傳性色素障礙以確定先前在受影響個體中鑒定的特定基因的功能。蛋白質O-巖藻糖基轉移酶1（pofut1）和早老素增強子-2（psenen）敲除斑馬魚均顯示色素沉著的異常分布，從而證實上述基因參與Dowling-Degos綜合征的某些臨床表現。此外，還創建了oca2突變斑馬魚和c10orf11敲除斑馬魚以在體內探索眼皮膚白化病相關基因功能，確認涉及整個魚類、小鼠和人類的保守基因功能。

圖2、斑馬魚在皮膚生物學中的應用

結論：炎癥性和腫瘤性皮膚病非常常見，并且在全球范圍內呈上升趨勢。斑馬魚可以作為合適的動物模型以擴大我們對皮膚疾病的分子和細胞機制的理解并在皮膚病學中開發新的治療策略。由于其低維護成本、高度保守的基因組和易于遺傳操作，斑馬魚是皮膚科實驗室臨床前研究的優秀模型，填補了體外細胞培養和體內哺乳動物模型之間的空白。

原文出自：The Zebrafish model in dermatology: an update for clinicians | SpringerLink