編者：1988 年《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動(dòng)我國(guó)科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)體系的完善、質(zhì)量檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)、質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)能力的提升、質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)的研究、質(zhì)量檢測(cè)工作的展開等方面，取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步與發(fā)展。
質(zhì)量管理是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的核心和切入點(diǎn)。在質(zhì)量管理方面，標(biāo)準(zhǔn)是依法管理的科學(xué)依據(jù)，許可證制度是依法管理的主要措施，而質(zhì)量監(jiān)測(cè)則是標(biāo)準(zhǔn)能夠得以落實(shí)、許可證制度得以實(shí)施的技術(shù)支撐條件保障。建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，依法開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)，為科學(xué)監(jiān)管提供依據(jù)。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)介紹我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)領(lǐng)域所開展的工作及取得的成果。
一、課題提出的背景與意義
作為科技條件資源，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是引領(lǐng)生命科學(xué)研究和發(fā)展的重要支撐保障條件，是生命科學(xué)和生物技術(shù)創(chuàng)新的基礎(chǔ)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物得以應(yīng)用的基本前提，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量決定著生命科學(xué)等領(lǐng)域研究工作的質(zhì)量和水平。隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)快速發(fā)展，突顯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的迫切需求，特別是國(guó)家重大疾病防治與新藥創(chuàng)制戰(zhàn)略的實(shí)施，以及國(guó)際科技交流的不斷增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)體系的不完善，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化水平等問(wèn)題也逐漸暴露出來(lái)。
農(nóng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牛、羊、鴨、貓、水貂、豬、馬等，國(guó)家并沒(méi)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)的缺失造成了我國(guó)大量非標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物應(yīng)用于教學(xué)、科研、生產(chǎn)及藥品檢定，造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)危害。因此我國(guó)亟需建立相關(guān)農(nóng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法。
與國(guó)際發(fā)達(dá)國(guó)家相比，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)項(xiàng)目仍然落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，隨著全球一體化的發(fā)展，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)檢測(cè)方法已經(jīng)和國(guó)際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)存在一定的差距，也使得一些病原微生物因我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)過(guò)低而隨著動(dòng)物引進(jìn)帶入國(guó)內(nèi)。因此，結(jié)合我國(guó)實(shí)際情況，完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，相應(yīng)增加檢測(cè)項(xiàng)目，逐步與國(guó)際相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)接軌十分必要。
近年來(lái)，隨著病原微生物檢測(cè)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)檢測(cè)方法亟待改進(jìn)，以提高檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性與準(zhǔn)確性。抗原蛋白超靈敏檢測(cè)技術(shù)，基因芯片檢測(cè)技術(shù)，多重 PCR/熒光定量 PCR 檢測(cè)等技術(shù)近幾年獲得了較大的發(fā)展，已經(jīng)應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域并有相關(guān)試劑盒產(chǎn)品問(wèn)世，但在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域并未應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)效率有待提高，亟需建立多種病原微生物的聯(lián)合、快速的檢測(cè)方法。
在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)發(fā)展水平較高的一些國(guó)家，商品化、系列化的檢測(cè)試劑盒已較為成熟。這些試劑盒的應(yīng)用， 極大地滿足檢測(cè)工作的需要，檢測(cè)工作的質(zhì)量也得到了保證。雖然從國(guó)外可以買到部分商品化供應(yīng)的試劑盒， 但價(jià)格昂貴，對(duì)我們來(lái)講不是解決檢測(cè)試劑來(lái)源的一個(gè)切實(shí)可行的途徑。為實(shí)施實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證管理制度和我國(guó)系列實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作的法制化和科學(xué)化管理，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量提高，充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)在保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量中的作用，研制標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)試劑盒已成為當(dāng)務(wù)之急。
本項(xiàng)目選擇常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、新培育實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、擬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化農(nóng)用動(dòng)物等病原微生物及寄生蟲檢測(cè)技術(shù)為研究對(duì)象，以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)方法研究為主題，力爭(zhēng)在 3-5 年內(nèi)實(shí)現(xiàn)我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)試劑的標(biāo)準(zhǔn)化。建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品種的病原微生物和寄生蟲檢測(cè)技術(shù),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新發(fā)傳染病病原微生物和寄生蟲檢測(cè)技術(shù), 應(yīng)用新技術(shù)改進(jìn)與完善現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傳染病病原微生物和寄生蟲檢測(cè)方法，參考國(guó)際先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傳染病病原微生物和寄生蟲檢測(cè)方法，建立質(zhì)量檢測(cè)新方法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)價(jià)技術(shù)平臺(tái)，推進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傳染病病原微生物檢測(cè)試劑的注冊(cè)與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。彌補(bǔ)我國(guó)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)試劑種類不多、質(zhì)量不高、制備不規(guī)范、評(píng)價(jià)不全面、針對(duì)性不強(qiáng)等不足，豐富和完善現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)方法，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源的開發(fā)利用，進(jìn)而推動(dòng)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究與發(fā)展。
二、課題研究任務(wù)的主要內(nèi)容及任務(wù)分工
（一）實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物新品種的病原檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用
1.實(shí)驗(yàn)用貓病原檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用：建立 4 種貓易感病毒病原體（泛白細(xì)胞減少癥病毒、貓皰疹病毒、貓免疫缺陷病毒、貓杯狀病毒）的 ELISA 或膠體金等檢測(cè)方法。建立 2 種貓細(xì)菌檢測(cè)方法。貓螺桿菌 LAMP 檢測(cè)方法，貓巴爾通體熒光定量 PCR 檢測(cè)方法。建立貓弓形蟲 ELISA 檢測(cè)方法。 在此基礎(chǔ)上，研究制定實(shí)驗(yàn)用貓微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（研究稿）及檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（研究稿）。
承擔(dān)單位分工：吉林大學(xué)，中國(guó)食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)的建立工作，河北醫(yī)科大學(xué)負(fù)責(zé) 檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作。
2.實(shí)驗(yàn)用牛病原檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用：建立 3 種實(shí)驗(yàn)用牛易感病毒病病原體檢測(cè)方法，包括瘋牛病 qPMCA 檢測(cè)方法，牛傳染性鼻氣管炎病毒熒光 PCR 檢測(cè)方法，牛病毒性腹瀉快速 RT-PCR 檢測(cè)方法。建立 2 種實(shí)驗(yàn)用牛的易感細(xì)菌病病原體檢測(cè)方法，包括：牛布魯氏菌 PCR 檢測(cè)方法、LAMP 檢測(cè)方法，牛結(jié)核病雙抗體夾心 ELISA 早期診斷方法。建立實(shí)驗(yàn)用牛人獸共患寄生蟲牛腸道原蟲（隱孢子蟲、賈第蟲等）多重快速鑒別 PCR 檢測(cè)方法。在此基礎(chǔ)上，研究制定實(shí)驗(yàn)用牛微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（研究稿）及檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（研究稿）。
承擔(dān)單位分工：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、軍事科學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所、內(nèi) 蒙古大學(xué)和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)負(fù)責(zé)相應(yīng)的病毒及細(xì)菌檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作，吉林大學(xué)負(fù)責(zé)寄生蟲檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。內(nèi)蒙古大學(xué)和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)負(fù)責(zé)檢測(cè)方法的驗(yàn)證和田間實(shí)驗(yàn)工作。
3.實(shí)驗(yàn)用羊病原微生物和寄生蟲的檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用：建立 4 種實(shí)驗(yàn)用羊易感病毒病病原體檢測(cè)方法， 包括：羊癢病 qPMCA 檢測(cè)方法，藍(lán)舌病病毒抗原、抗體 ELISA 檢測(cè)方法，山羊痘和綿羊痘通用 PCR 檢測(cè)方法及特異性鑒別多重 PCR 檢測(cè)方法的建立。建立 1 種實(shí)驗(yàn)用羊的易感細(xì)菌病病原體檢測(cè)方法。包括：羊布魯氏菌OMP2 基因快速 PCR 檢測(cè)方法、BCSP31 基因 LAMP 檢測(cè)方法、多重 PCR 檢測(cè)方法。建立實(shí)驗(yàn)用羊人獸共患寄生蟲羊腸道原蟲（隱孢子蟲、賈第蟲等）多重快速 PCR 鑒別檢測(cè)方法。 在此基礎(chǔ)上，研究制定實(shí)驗(yàn)用羊微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（研究稿）及檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（研究稿）。
承擔(dān)單位分工：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、軍事科學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所、內(nèi) 蒙古大學(xué)和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)負(fù)責(zé)相應(yīng)的病毒及細(xì)菌檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作，吉林大學(xué)負(fù)責(zé)寄生蟲檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。內(nèi)蒙古大學(xué)和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)負(fù)責(zé)檢測(cè)方法的驗(yàn)證和田間實(shí)驗(yàn)工作。
4.實(shí)驗(yàn)用 SPF 級(jí)鴨病原微生物和寄生蟲的檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用：建立 3 種 SPF 鴨病毒的病原體檢測(cè)方法， 包括：鴨肝炎、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒分離鑒定及 PCR（RT-PCR）檢測(cè)方法。建立 1 種 SPF 鴨細(xì)菌病病原體(李默氏桿菌或大腸桿菌) PCR 檢測(cè)方法。建立 1 種 SPF 鴨球蟲鏡檢及 PCR 檢測(cè)方法。 在此基礎(chǔ)上，研究制定 SPF 鴨微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（研究稿）及檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（研究稿）。
承擔(dān)單位分工：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所負(fù)責(zé)相應(yīng)病毒、細(xì)菌檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作， 吉林大學(xué)負(fù)責(zé)寄生蟲檢測(cè)方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。
（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新發(fā)傳染病病原的檢測(cè)新技術(shù)集成創(chuàng)新與應(yīng)用
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新發(fā)傳染病監(jiān)測(cè)新技術(shù)研究與應(yīng)用：小鼠新發(fā)傳染病：小鼠 K 病毒、小鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒；地鼠新發(fā)傳染病：漢坦病毒、小鼠肝炎病毒、猴病毒 5 和吐蘭 H-a 病毒；犬傳染病：狂犬病病毒、犬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、犬巴爾通體；猴新發(fā)傳染病：猴泡沫病毒。
承擔(dān)單位分工：中國(guó)食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)小鼠、地鼠新發(fā)傳染病，猴泡沫病毒檢測(cè)方法建立，中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所負(fù)責(zé)犬傳染病檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)的建立工作。
2.檢測(cè)新技術(shù)集成創(chuàng)新與應(yīng)用：分別建立猴 B 病毒、狂犬病病毒超靈敏抗原蛋白金納米探針檢測(cè)方法；建立小鼠病毒和細(xì)菌多重 PCR 檢測(cè)方法；針對(duì)兔出血癥病毒、犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒和傳染性犬肝炎病毒構(gòu)建假病毒表達(dá)系統(tǒng)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲診斷技術(shù)改進(jìn)與完善，猴結(jié)核病檢測(cè)技術(shù)改進(jìn)與完善。
承擔(dān)單位分工：軍事科學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所負(fù)責(zé)超靈敏抗原蛋白金納米探針檢測(cè)方法建立，河北醫(yī)科大學(xué)負(fù)責(zé)小鼠病毒細(xì)菌多重 PCR 檢測(cè)方法建立，中國(guó)食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中和抗體檢測(cè)技術(shù)建立，吉林大學(xué)負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲診斷技術(shù)改進(jìn)與完善，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)負(fù)責(zé)猴結(jié)核病檢測(cè)技術(shù)改進(jìn)與完善。
（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病病原診斷試劑產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用
1.新產(chǎn)品臨床申報(bào)和注冊(cè)：完成 4 種 SPF 雞疫病病原/抗體檢測(cè)試劑盒開發(fā)，并完成其中 2 種新產(chǎn)品臨床申報(bào)和注冊(cè)。2.新開發(fā)試劑盒產(chǎn)業(yè)化。
承擔(dān)承擔(dān)單位分工：動(dòng)物用生物制品國(guó)家工程研究中心負(fù)責(zé)新檢測(cè)試劑臨床申報(bào)和注冊(cè)工作，同時(shí)項(xiàng)目各 參加單位研發(fā)的成熟產(chǎn)品優(yōu)先通過(guò)工程中心進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。
三、課題研究要解決的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)
（一）實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物合格的陰性與陽(yáng)性血清對(duì)照采集
雖然貓、牛、羊、鴨等已被用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)，但國(guó)內(nèi)并未建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物群體，因此，對(duì)這些動(dòng)物所攜帶的病原微生物并不清楚，部分動(dòng)物易感病原微生物對(duì)其自身危害小，但隱性攜帶率較高，陰性血清樣本的獲得較困難。篩選病原微生物陰性動(dòng)物也是本項(xiàng)目的工作難點(diǎn)之一。同時(shí)，還應(yīng)區(qū)分動(dòng)物的自然感染與免疫后抗體升高的情況，從而獲得合格的陰性與陽(yáng)性血清對(duì)照，這是建立實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原微生物血清學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)。
（二）檢測(cè)用抗體特異性和親和力
獲得病原微生物高特異性和親和力的病毒單抗是保證 ELISA 免疫學(xué)檢測(cè)特異性和敏感性的關(guān)鍵，可通過(guò)篩選來(lái)獲得符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的單抗，同時(shí)具備高特異性和效價(jià)的單抗可用于相應(yīng)病原微生物的檢測(cè)。
（三）引物及熒光探針特異性和敏感性
核酸檢測(cè)探針以及 PCR 引物均是檢測(cè)特異性和敏感性的關(guān)鍵因素，多重 PCR/熒光定量 PCR 反應(yīng)體系較為復(fù)雜，在生物條形碼檢測(cè)技術(shù)研究中，除了要求具備高特異性和親和力的單抗外，條形碼 DNA 的熒光定量 PCR 檢測(cè)也關(guān)系到檢測(cè)的準(zhǔn)確性。可利用生物信息學(xué)方法等設(shè)計(jì)和篩選核酸探針和 PCR 引物，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以確保檢測(cè)的特異性和敏感性。
（四）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物檢測(cè)試劑的注冊(cè)與產(chǎn)業(yè)化
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物檢測(cè)試劑的開發(fā)，從技術(shù)層面分析，對(duì)所有的項(xiàng)目參加單位都不困難，但是將檢測(cè)方法最終開發(fā)成商品化的檢測(cè)試劑，需要有較長(zhǎng)的過(guò)程。新獸藥證書是檢測(cè)試劑產(chǎn)品孵化、轉(zhuǎn)化的必要條件，本項(xiàng)目吸收了動(dòng)物用生物制品國(guó)家工程研究中心并主要承擔(dān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病病原檢測(cè)試劑產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工作，借助其動(dòng)物疫病檢測(cè)制品 GMP 生產(chǎn)線及具有經(jīng)驗(yàn)豐富經(jīng)驗(yàn)的新獸藥注冊(cè)團(tuán)隊(duì)，快速推進(jìn)新獸藥的申報(bào)，全面提升項(xiàng)目成果轉(zhuǎn)化、孵化能力，為項(xiàng)目成果的推廣應(yīng)用提供必要的保障，也為今后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物檢測(cè)試劑注冊(cè)與產(chǎn)業(yè)化工作起到示范作用。
（五）實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原微生物標(biāo)準(zhǔn)毒株與菌種
建立實(shí)驗(yàn)用貓、牛、羊、鴨病原微生物檢測(cè)方法，首先需要培養(yǎng)純化標(biāo)準(zhǔn)毒株或菌種，在本研究需要建立的病原微生物檢測(cè)技術(shù)中，絕大多數(shù)病原微生物，國(guó)內(nèi)都已經(jīng)分離了該毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株，但貓的部分病毒病，國(guó)內(nèi)并未分離出標(biāo)準(zhǔn)毒株，在前期研究工作中，項(xiàng)目組從 ATCC 引進(jìn)了部分標(biāo)準(zhǔn)毒株，并進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)。由于病毒存在較大的變異性，因此，在建立檢測(cè)方法時(shí)，還需要將引進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)毒株與國(guó)內(nèi)分離的野毒株進(jìn)行比較， 確保檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，特別是在建立 PCR 等基因水平檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)盡可能選取病毒 N 蛋白等保守序列作為檢測(cè)目的片段，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
（六）實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原微生物檢測(cè)中組織分布豐度的確定
實(shí)驗(yàn)用貓、牛、羊、鴨篩選出合適的病原學(xué)檢測(cè)方法也多有不同，每種重大疫病在動(dòng)物體內(nèi)的感染發(fā)病機(jī)制不盡相同，特別是新發(fā)感染性疾病病原，面臨的第一個(gè)問(wèn)題是疫病發(fā)生模式，不同疫病病原在動(dòng)物體內(nèi)不同組織分布豐度（組織嗜性）不同，因此同一來(lái)源樣品（如肝臟樣品或血清樣品）針對(duì)多種疫病病原檢測(cè)的敏感性不盡相同，建立多種重大疫病病原學(xué)聯(lián)合鑒別檢測(cè)方法時(shí)需確定合適采樣部位。
（七）生物安全問(wèn)題
本項(xiàng)目所涉及的牛海綿狀腦病、羊癢病、藍(lán)舌病等為國(guó)家規(guī)定的一類動(dòng)物疫病，需要在動(dòng)物生物安全三級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)研究工作，申請(qǐng)單位雖都已經(jīng)具備相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，但在研究工作中仍需避免病原微生物的泄露，同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室及參與研究工作的研究生進(jìn)行培訓(xùn)，嚴(yán)防病原微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)人員產(chǎn)生危害。
四、課題研究取得的成果
課題組經(jīng)過(guò)三年的聯(lián)合攻關(guān)，緊緊圍繞實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原分子生物學(xué)快速檢測(cè)新技術(shù)研究與應(yīng)用這一領(lǐng)域開展了深入系統(tǒng)的研究，主要對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物新品種的病原檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新發(fā)傳染病病原的檢測(cè)新技術(shù)集成創(chuàng)新與應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病病原診斷試劑產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用方面開展研究工作。
（一）實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物新品種的病原檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用
建立了貓皰疹病毒Ⅰ型 PCR 檢測(cè)方法、抗體 ELISA 檢測(cè)方法；貓皰疹病毒Ⅰ型抗體 ELISA 檢測(cè)方法的；貓細(xì)小病毒 PCR 檢測(cè)方法的建立；貓細(xì)小病毒和貓皰疹病毒 I 型熒光定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)；貓細(xì)小病毒和貓皰疹病毒 I 型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)；貓杯狀病毒膠體金及 ELISA 檢測(cè)試紙條；貓沙門氏菌的分離鑒定及 PCR 檢測(cè)技術(shù)；貓螺桿菌 LAMP 檢測(cè)方法；貓嗜肺巴斯德桿菌的分離鑒定及 PCR 檢測(cè)技術(shù)；貓巴爾通體實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)方法；貓弓形蟲間接 ELISA 檢測(cè)方法；貓弓形蟲 Dot-ELISA 檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)用貓共計(jì)建立了 8 種病原體的 16 種檢測(cè)方法。所建立的檢測(cè)方法靈敏、特異、重復(fù)性好。
建立了實(shí)驗(yàn)用貓病原微生物和寄生蟲質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)，完善了實(shí)驗(yàn)用貓標(biāo)準(zhǔn)化體系。
建立了實(shí)驗(yàn)用牛、羊布魯氏菌 PCR 和 LAMP 檢測(cè)方法；實(shí)驗(yàn)用牛、羊布魯氏菌膠體金檢測(cè)試紙條；牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法；羊傳染性膿皰實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法；牛傳染性鼻氣管炎病毒雙重基因 PCR 檢測(cè)方法；牛支原體 PCR 檢測(cè)方法；實(shí)驗(yàn)用牛的瘋牛病、羊的羊癢病 qPMCA 技術(shù)檢測(cè)方法；牛病毒性腹瀉抗原、抗體 ELISA 檢測(cè)方法；牛結(jié)核病雙抗體夾心 ELISA 早期診斷方法；山羊痘和綿羊痘 PCR 檢測(cè)技術(shù)； 山羊痘和綿羊痘病毒 qPCR 檢測(cè)方法；羊藍(lán)舌病病毒抗原、抗體 ELISA 檢測(cè)方法；實(shí)驗(yàn)用牛十二指腸賈第蟲、微小隱孢子蟲與安氏微小隱孢子蟲三重 PCR 檢測(cè)方法；實(shí)驗(yàn)用羊賈第蟲與隱孢子蟲雙重 PCR 檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)用牛共計(jì)建立了 17 種病原的 18 種檢測(cè)方法。所建立的檢測(cè)方法靈敏、特異、重復(fù)性好。
建立了實(shí)驗(yàn)用牛、羊的病原微生物和寄生蟲質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)，完善了實(shí)驗(yàn)用牛、羊標(biāo)準(zhǔn)化體系。
建立了實(shí)驗(yàn)用 SPF 級(jí)鴨鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒病原分離鑒定方法；鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒二重 PCR 檢測(cè)方法；鴨圓環(huán)病毒 PCR 檢測(cè)方法的建立；禽致病性大腸桿菌多重 PCR 檢測(cè)方法；鴨球蟲 PCR 檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)用SPF 鴨共計(jì) 5 種病原 6 種檢測(cè)方法。所建立的檢測(cè)方法靈敏、特異、重復(fù)性好。
建立了實(shí)驗(yàn)用 SPF 級(jí)鴨的病原微生物和寄生蟲質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)，完善了實(shí)驗(yàn)用 SPF 級(jí)鴨標(biāo)準(zhǔn)化體系。
（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新發(fā)傳染病病原的檢測(cè)新技術(shù)集成創(chuàng)新與應(yīng)用
建立了小鼠 k 病毒 PCR 檢測(cè)方法；猴泡沫病毒（SFV）RT-nestPCR 檢測(cè)方法；猴泡沫病毒血清學(xué)檢測(cè)方法； 猴副流感病毒 PCR 檢測(cè)方法；大、小鼠多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體和肺炎克雷伯桿菌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體多重 PCR 檢測(cè)方法；小鼠金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌和肺支原體多重PCR 檢測(cè)方法；大鼠細(xì)小病毒 H-1 株 PCR 檢測(cè)方法；大鼠冠狀病毒、仙臺(tái)病毒的多重 PCR 檢測(cè)方法。共計(jì)建立了 15 種病原的 8 種單項(xiàng)或多重檢測(cè)方法。
建立了猴 B 病毒、狂犬病病毒的超靈敏抗原蛋白金納米探針檢測(cè)技術(shù)；猴 B 病毒和人皰疹病毒鑒定技術(shù)； 小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR 檢測(cè)方法；狂犬病病毒 RT-PCR 和熒光定量 PCR 檢測(cè)方法；犬細(xì)小病毒 PCR 及熒光定量檢測(cè)方法；犬偽狂犬病毒 PCR 及熒光定量檢測(cè)方法；犬嗜血巴爾通體 PCR 及熒光定量檢測(cè)方法；犬瘟熱病毒（CDV）假病毒系統(tǒng)；犬細(xì)小病毒（CPV）假病毒；犬腺病毒 2 型病毒假病毒；兔出血癥病毒假病毒；鼠毛滴蟲巢式 PCR 檢測(cè)方法；兔艾美爾球蟲巢式 PCR 檢測(cè)方法。共建立了 13 種病原的 19 種檢測(cè)新技術(shù)。
共計(jì)建立了 15 種病原的 8 種單項(xiàng)或多重檢測(cè)方法。共建立了 13 種病原的 19 種檢測(cè)新技術(shù)。
以上所建立的檢測(cè)方法靈敏、特異、重復(fù)性好。
（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病病原診斷試劑產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用
完成禽白血病群特異性抗原 ELISA 檢測(cè)試劑盒；雞傳染性法氏囊病病毒 ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒；雞傳染性法氏囊病病毒瓊脂擴(kuò)散抗原、及陰陽(yáng)性血清；禽白血病病毒群特異抗原檢測(cè)試紙條的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。新開發(fā)雞傳染性支氣管炎病毒 ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒 1 項(xiàng)，預(yù)計(jì)后續(xù)也將申報(bào)新獸藥臨床試驗(yàn)。
課題執(zhí)行過(guò)程中，共申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利 10 件，授權(quán) 4 件；獲新獸藥證書 2 項(xiàng)；發(fā)表論文 54 篇，其中SCI 收錄文章 20 篇；制定并頒布實(shí)驗(yàn)用貓微生物、寄生蟲吉林省地方標(biāo)準(zhǔn) 2 項(xiàng)；培養(yǎng)碩士研究生 16 名、博士研究生 5 名、博士后 2 名；完成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員教材 2 部，組織全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn) 2 次，培訓(xùn)相關(guān)檢測(cè)人員 150 人次。
最終完成了任務(wù)書中規(guī)定的各項(xiàng)研究?jī)?nèi)容和考核指標(biāo)。五、快檢技術(shù)在我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用的展望實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是引領(lǐng)生命科學(xué)研究和發(fā)展的重要支撐保障條件，是生命科學(xué)和生物技術(shù)創(chuàng)新的基礎(chǔ)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物得以應(yīng)用的基本前提，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量決定著生命科學(xué)等領(lǐng)域研究工作的質(zhì)量和水平。雖然經(jīng)過(guò)課題組 3 年不懈努力，建立了一批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)方法新方法，新技術(shù)，新試劑，但是距離我國(guó)目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)的需要仍有不小的差距。
（一）實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物方面還有很長(zhǎng)的路要走
針對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物新品種質(zhì)量控制方面本課題由于不斷的前期組合，包含了 4 個(gè)新的實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物新品種（貓， 牛，羊，鴨），雖然各個(gè)單位在不同的領(lǐng)域存在各自的優(yōu)勢(shì)，但是由于各個(gè)新品種的研究基礎(chǔ)不同，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化程度不同，群體規(guī)模也不同，本課題雖然很好的整合了各個(gè)參加單位的優(yōu)勢(shì)力量，集中攻關(guān)，但研究?jī)?nèi)容過(guò)于繁雜，難免會(huì)造成重此輕彼的情況，各個(gè)物種進(jìn)度很難協(xié)調(diào)一致。未來(lái)科技主管部門在以后的課題頂層設(shè)計(jì)過(guò)程中，應(yīng)突出單一物種，逐個(gè)重點(diǎn)攻關(guān)，這樣更能高效的解決我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化所面對(duì)的問(wèn)題。
（二）檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化程度不高，推廣應(yīng)用時(shí)間不足
各個(gè)課題組建立的試劑盒和檢測(cè)試劑的制備以基本完成，部分專利也進(jìn)入了申報(bào)階段，部分試劑盒也進(jìn)入報(bào)批階段。但是試劑盒和檢測(cè)方法的推廣應(yīng)用未的到充分的開發(fā)，相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定和頒布略顯落后。各個(gè)課題承擔(dān)單位應(yīng)進(jìn)一步對(duì)所建立的試劑盒及檢測(cè)方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化開發(fā)，進(jìn)一步制定相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，將所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行充分的推廣應(yīng)用實(shí)踐，更好的為科研生產(chǎn)服務(wù)。
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