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摘要：輪狀病毒（RV）是引起嬰兒腹瀉的主要病原體之一，目前尚無有效藥物治療RV引起的嬰兒腹瀉。因此，新模型的開發(fā)對(duì)于RV誘導(dǎo)的嬰兒腹瀉的病理研究以及相關(guān)治療策略的進(jìn)展具有重要意義。本文首次介紹了RV- Wa株和RV-SA-11株可感染5 dpf和28 dpf仔魚，以誘導(dǎo)與嬰兒臨床感染高度一致的嬰兒腹瀉模型。RV感染顯著改變了仔魚的體征、生存率和炎癥反應(yīng)。還分析了一些重要指標(biāo)，包括RV抗原VP4和VP6的水平、體內(nèi)RV跟蹤和RV顆粒，這些指標(biāo)共同證明成功建立了輪狀病毒斑馬魚模型。更重要的是，我們還確定了擬議的RV感染斑馬魚模型用于抗病毒藥物評(píng)估的潛力。總之，我們建立了一個(gè)RV感染斑馬魚模型，并制定了相關(guān)指標(biāo)，可作為抗病毒藥物篩選的高通量平臺(tái)。

簡(jiǎn)介：嬰兒腹瀉是全世界五歲以下兒童死亡的第二大原因，每年造成約525000人死亡，特別是在發(fā)展中國家。嬰兒腹瀉是一種急性疾病，可導(dǎo)致嘔吐、嚴(yán)重脫水和數(shù)天內(nèi)死亡。嬰兒腹瀉的主要原因之一是RV。然而，到目前為止，RV引起的嬰兒腹瀉的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前還沒有有效的藥物治療該疾病。已經(jīng)建立了幾種模型來探討其致病機(jī)制，包括MA104和Caco-2等細(xì)胞模型、小鼠、豬、猴、犬、牛、羊、兔等動(dòng)物模型以及新建立的腸道類器官模型。細(xì)胞模型不能模擬疾病的過程，乳鼠模型由于母鼠的傷害和咬傷，幼鼠之間的均一性較差，因此不適合抗病毒藥物篩選。無菌豬模型繁殖難度大，研究成本極高，嚴(yán)重制約了其廣泛應(yīng)用。模型的短缺嚴(yán)重阻礙了RV研究和相關(guān)藥物開發(fā)的進(jìn)程。因此，建立一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、簡(jiǎn)便的RV新型動(dòng)物模型，對(duì)于分析RV引起嬰兒腹瀉的病理機(jī)制和篩選抗RV藥物具有重要意義。斑馬魚已迅速成為脊椎動(dòng)物發(fā)育和基因功能研究的優(yōu)良生物學(xué)模型，因?yàn)椋?(1) 斑馬魚卵在母體外受精和發(fā)育； (2) 基因操作簡(jiǎn)單； (3)后代數(shù)量多； (4) 繁殖周期短； (5) 胚胎是透明的，可以進(jìn)行器官的活體成像； (6) 與人類基因同源性高。 已經(jīng)在斑馬魚上開發(fā)了一系列針對(duì)人類疾病的病理模型，如敗血癥、癌癥、肥胖癥、糖尿病等。最近，斑馬魚在腸道炎癥方面得到了廣泛的研究。化學(xué)治療如DSS、TNB、螺旋酮、非甾體抗炎藥、脂質(zhì)多糖或敲除一些炎癥性腸炎樣基因，如PIK3C3/vps34，可以創(chuàng)建斑馬魚腸道病理模型。已經(jīng)建立了一系列感染斑馬魚的水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)病毒，如鯉魚春季病毒血癥病毒（SVCV）、病毒性出血性膿毒癥病毒（VHSV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、蛇頭彈狀病毒（SHRV）、神經(jīng)壞死病毒（NNV）。同時(shí)，出現(xiàn)了人類易感病毒感染的斑馬魚模型，如單純皰疹病毒-1（HSV-1）、基孔肯亞病毒（CHIKV）、甲型流感病毒（IAV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染的斑馬魚模型，這表明建立RV感染的斑馬魚模型對(duì)于進(jìn)一步研究嬰兒腹瀉具有良好的前景。本研究首次成功鑒定RV-Wa和RV-SA-11可感染5dpf和28dpf仔魚。仔魚感染后體內(nèi)可檢測(cè)到RV抗原VP4和VP6，同時(shí)仔魚形態(tài)、炎癥因子mRNA表達(dá)、炎癥相關(guān)細(xì)胞和腸道組織病理學(xué)發(fā)生明顯改變。

圖1、斑馬魚感染RV的實(shí)驗(yàn)程序。

感染情況篩查：5dpf仔魚：用浸泡法感染仔魚。我們調(diào)查了2:1、1:1和1:2的不同病毒感染率，以探索最佳感染率。感染SA-11和Wa株的5 dpf仔魚的存活曲線如圖2A所示。不同比例感染的仔魚表現(xiàn)出不同程度的病變，如圖2B所示。感染24 h后，將仔魚安樂死并解剖腸道，隨后用于檢測(cè)VP6抗原。如圖2C所示，感染比例為1:2的SA-11和Wa株生存率最高，感染的仔魚表現(xiàn)出不同程度的病變，包括心包腫脹、皮膚粗糙、脊柱彎曲，甚至畸形。感染比例為2:1和1:1的SA-11和Wa病毒株生存率較低，大部分感染仔魚死亡。同時(shí)，ELISA法結(jié)果表明，SA-11和Wa株的仔魚體內(nèi)均存在VP6抗原，感染比例為1:2。

圖 2. 感染條件的篩選。 5 dpf仔魚感染條件篩選結(jié)果如圖A-C所示。（A：SA-11和Wa株感染5dpf仔魚的存活曲線。B:5dpf仔魚感染后的病變C：SA-11和Wa株1:2感染組5dpf仔魚中抗原VP6的ELISA檢測(cè)）。28 dpf仔魚感染情況篩選結(jié)果見D-F。

28 dpf斑馬魚仔魚：通過腹腔注射、灌胃和浸泡 RV 法研究了 28 dpf 仔魚的感染。 根據(jù)28 dpf仔魚的存活曲線，發(fā)現(xiàn)腹腔注射感染組和對(duì)照組的死亡率均較高。第一天，生存率降至50%左右，隨后幾天下降至20%。生存率迅速下降的原因可能是腹腔注射損傷了內(nèi)臟器官，注射針直徑過大造成的傷口難以恢復(fù)。從安全的角度來看，這種感染方式不利于模型的建立。 浸泡組生存率最高，達(dá)90%以上。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)浸泡組的仔魚出現(xiàn)腹瀉。與正常組相比，感染組水質(zhì)渾濁，糞便呈白色，呈細(xì)棒狀或散成細(xì)顆粒狀，松軟柔軟，部分魚的肛門出現(xiàn)炎癥。此外，ELISA方法的結(jié)果表明，浸泡組28 dpf仔魚中存在抗原VP6。

90 dpf斑馬魚：我們還研究了腹腔注射、灌胃和RV浸泡對(duì)90 dpf斑馬魚的感染。SA-11病毒株感染的三種不同方式對(duì)90 dpf斑馬魚的生存率沒有顯著影響，感染后斑馬魚沒有腹瀉。攝食和行為能力與正常組無顯著性差異。采用ELISA法檢測(cè)90 dpf斑馬魚腸道中RV抗原VP6的表達(dá)，結(jié)果表明90 dpf斑馬魚腸道中沒有RV抗原VP6。這些結(jié)果表明，90 dpf斑馬魚對(duì)RV SA-11株和Wa株不敏感，這可能與90dpf斑馬魚建立了抵抗病毒感染的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)有關(guān)。

5 dpf 斑馬魚仔魚 RV 感染指標(biāo)：活體成像：5 dpf 仔魚感染熒光標(biāo)記的 RV SYTO-SA-11 和 SYTO-Wa株。SYTO-SA-11感染4 h后，紅色熒光逐漸在腸道內(nèi)積聚。 感染6 h后，熒光在仔魚腸道頂部和腦內(nèi)積聚，10 h后在腦內(nèi)逐漸增強(qiáng)。感染14 h后，腸內(nèi)熒光逐漸減弱，腦內(nèi)熒光持續(xù)增強(qiáng)。同樣，感染4 h后在腸道和大腦中也觀察到紅色熒光SYTO-Wa感染的仔魚，然后在感染10 h和12 h后主要轉(zhuǎn)移并積聚到大腦中。

圖3. A：紅色熒光是用核酸染料標(biāo)記的RV。 RV 首先在仔魚的腸道中觀察到。

抗原VP4檢測(cè)：用ELISA法檢測(cè)仔魚RV的VP4抗原。 VP4抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = 0.0144x+ 0.116（R2=0.9921，表明在0.5 ng/L-18 ng/L范圍內(nèi)呈很好的線性關(guān)系。SA-11株或Wa株感染2天后，5dpf仔魚腸道中RV抗原VP4的表達(dá)如圖3B所示。結(jié)果表明，SA-11株感染組和Wa株感染組在感染24 h后病毒抗原VP4含量最高，分別為1.48 ng/L和2.16 ng/L。

qPCR：RV感染可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子（如IL-1β）的分泌和IL-6、IL-8和TNF-αmRNA表達(dá)水平的升高。據(jù)報(bào)道，隨著疾病的進(jìn)展，IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表達(dá)水平增加。因此，我們可以利用qPCR檢測(cè)感染后仔魚體內(nèi)炎癥相關(guān)因子表達(dá)的變化，從而預(yù)測(cè)仔魚感染情況。從麻醉下不同時(shí)間點(diǎn)的5dpf仔魚中提取總RNA。檢測(cè)各組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)。 與正常組相比，SA-11感染組和Wa感染組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)均顯著升高。

圖4、A：炎癥因子的表達(dá)。感染RV SA-11株和Wa株的5dpf仔魚中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的觀察：SA-11株和Wa株感染5dpf仔魚24 h后，體內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集情況如圖5A和B所示。正常組的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞主要集中在仔魚的大腦和血液島中。與正常組相比，SA-11株感染組和Wa株感染組巨噬細(xì)胞在腸道和肛門周圍有明顯聚集，感染組中性粒細(xì)胞在腸道周圍有明顯聚集。SA-11株和Wa株感染5dpf仔魚24h后吖啶橙染色結(jié)果如圖5C所示。與正常組相比，SA-11感染組和Wa感染組腸道周圍可見明顯的黃綠色熒光，提示細(xì)胞凋亡。

圖5.化學(xué)染色條件。（A：中性紅染色觀察巨噬細(xì)胞。B：蘇丹紅B染色觀察巨噬細(xì)胞。C：吖啶橙染色觀察凋亡細(xì)胞。）

28dpf斑馬魚仔魚RV感染指標(biāo)：

28dpf仔魚在感染RV SA-11株和Wa株24 h~72 h后出現(xiàn)不同程度的腹瀉，如圖6所示。與正常組相比，SA-11株感染組和Wa株感染組在感染24 h后均出現(xiàn)明顯腹瀉。感染SA-11毒株的仔魚糞便較淡，呈白色或淡黃色，松散點(diǎn)狀或絮狀。感染W(wǎng)a株后，糞便呈淡黃色、豆渣或蛋花，渾濁、不成形、質(zhì)地柔軟、易于觸摸。這些感染仔魚的腹瀉可持續(xù)2-3天。

圖6 A-C：正常組24、48、72 h的糞便； D-f：SA-11株感染組在24、48、72 h的糞便； G-I：Wa株感染組在24、48和72 h的糞便。

抗原VP4檢測(cè)：LISA法檢測(cè)仔魚腸道RV的VP4抗原。 抗原VP4的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = 0.0144x+ 0.116（R2=0.9921，在0.5 ng/L-18 ng/L范圍內(nèi)呈很好的線性關(guān)系。28dpf仔魚中抗原VP4的表達(dá)如圖7b所示。SA-11毒株感染組和Wa毒株感染組3天腸道內(nèi)均檢測(cè)到RV抗原VP4。 結(jié)果表明SA-11株感染組和Wa株感染組在感染24 h后病毒抗原VP4含量最高，分別為19.83 ng/L和21.98 ng/L。

圖7.A：透射電鏡觀察28dpf仔魚感染SA-11株和Wa株的腸道。7B:28dpf仔魚中抗原VP4的表達(dá)。

RV感染仔魚24小時(shí)后，HE染色觀察腸石蠟切片的病理變化。 正常組絨毛非常發(fā)達(dá)，縱橫交錯(cuò)或呈指狀，結(jié)構(gòu)致密清晰。單層柱狀上皮細(xì)胞排列緊密，在絨毛表面成簇排列，絨毛與腸腔緊密相連。與正常組相比，SA-11株感染組腸絨毛不清晰且高度減少，有空泡化、上皮細(xì)胞不完整或脫落，Wa株感染組腸絨毛大部分不完整，腺細(xì)胞大部分脫落，上皮細(xì)胞排列不規(guī)則。

斑馬魚是應(yīng)用最廣泛的模式生物之一，具有體積小、易飼養(yǎng)、產(chǎn)卵量大、胚胎發(fā)育同步、胚胎易于觀察、與人類基因同源性高等優(yōu)點(diǎn)。基于斑馬魚模型超越乳鼠模型和無菌豬模型的優(yōu)勢(shì)，因此，本文RV感染斑馬魚模型顯示了高通量和高抗RV藥物篩選的潛力。

原文出自：Establishment of a rotavirus-infected zebrafish model and its application in drug screening - ScienceDirect