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摘要：淋巴祖細(xì)胞的分化是淋巴管生成的關(guān)鍵步驟。 然而，其潛在機(jī)制仍不清楚。在這里，我們發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典蛋白酶激活受體 1 (par1) 調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎淋巴祖細(xì)胞的分化。通過下調(diào)脊索旁淋巴管母細(xì)胞中prox1a的表達(dá)，par1功能喪失而損害淋巴管分化，并導(dǎo)致斑馬魚胸導(dǎo)管形成受損。同時，par1 下游效應(yīng)子 G 蛋白 gnai2a 是斑馬魚淋巴發(fā)育的選擇性必需蛋白，其突變模擬了 par1 突變體中觀察到的淋巴管表型。有趣的是，斑馬魚淋巴管發(fā)育需要mmp13，而不是凝血酶。此外，對遺傳相互作用的分析證實(shí)，mmp13b作為par1上游蛋白酶調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎的淋巴管發(fā)育。機(jī)制上，par1促進(jìn)后主靜脈flt4表達(dá)和磷酸化Erk1/2活性。總之，我們的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了par1在斑馬魚胚胎淋巴管分化調(diào)節(jié)中的作用。

關(guān)鍵詞：生物科學(xué)  分子生物學(xué)  免疫學(xué)  斑馬魚 

簡介：淋巴系統(tǒng)是一個復(fù)雜的脈管系統(tǒng)，起源于預(yù)先存在的胚胎靜脈。 它在維持組織間液平衡和回收水和大分子、吸收脂質(zhì)以及為免疫細(xì)胞參與免疫監(jiān)視系統(tǒng)提供主要管道等方面具有重要作用。淋巴系統(tǒng)畸形可導(dǎo)致許多病理，例如組織液積聚、水腫或淋巴水腫、癌細(xì)胞擴(kuò)散和炎癥。在小鼠淋巴系統(tǒng)發(fā)育過程中，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (VEC) 亞群表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 prospero 同源盒蛋白 1 (PROX1)，并在胚胎第 9.5 天分化為主靜脈 (CV) 中的淋巴祖細(xì)胞。小鼠 prox1 的消融可防止淋巴管的發(fā)育，并且 prox1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞 (ECs) 中的異位表達(dá)可上調(diào)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞 (LEC) 標(biāo)志物。這些研究表明 prox1 是誘導(dǎo) LEC 命運(yùn)的必要和充分條件。在斑馬魚胚胎中，在受精后約 26 小時 (hpf) 早期在腹后主靜脈 (PCV) 內(nèi)誘導(dǎo)淋巴祖細(xì)胞。大約 48 hpf這些淋巴祖細(xì)胞遷移到水平肌中隔 (HM) 區(qū)域，形成脊索旁淋巴母細(xì)胞 (PLs)，這是一個淋巴前體細(xì)胞庫。隨后，PLs向兩個方向遷移，腹側(cè)形成胸導(dǎo)管（TD），背側(cè)形成背側(cè)縱向淋巴管（DLLV）；在受精后5天（dpf）左右完成。母體和合子prox1a突變體導(dǎo)致斑馬魚胚胎淋巴管發(fā)育缺陷，表明其在淋巴管系統(tǒng)中的保守作用。最近的研究表明，Vegfc-Flt4及其下游效應(yīng)子Erk1/2在斑馬魚軀干中的一個關(guān)鍵作用是誘導(dǎo)prox1a表達(dá)。蛋白酶激活受體1（PAR1）是一種G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），更具體地說，是一種凝血酶受體（F2r），在血管生物學(xué)中起著關(guān)鍵作用。它通過絲氨酸蛋白酶凝血酶 (F2) 在典型位點(diǎn)切割 N 末端外結(jié)構(gòu)域而被激活。然而，已發(fā)現(xiàn)其他 PAR1 上游蛋白酶可激活 PAR1。例如，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），特別是MMP1和MMP13，也可以在非標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)切割和激活PAR1，從而形成與F2不同的信號模式。一旦PAR1在標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)被不同蛋白酶不可逆地切割和激活，PAR1可以偶聯(lián)并激活多個異源三聚體G蛋白亞型，包括G12/13、G11/q和GI。這導(dǎo)致多種細(xì)胞信號事件，包括MAPK/ERK信號的激活。據(jù)報道，Par1在斑馬魚的造血和心血管發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。盡管par1在1 dpf時斑馬魚胚胎的PCV中富集，但其作用仍然未知。在此，我們報告Mmp13b-Par1-Gnai2a軸調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎中淋巴祖細(xì)胞的分化。在機(jī)制上，我們表明par1通過調(diào)節(jié)flt4的表達(dá)促進(jìn)Erk1/2活性和prox1a的表達(dá)。

par1是斑馬魚胚胎軀干淋巴管發(fā)育所必需的：PCV 是斑馬魚胚胎軀干淋巴祖細(xì)胞的來源。有趣的是，我們的整體原位雜交（WISH）結(jié)果表明，par1 在 26 hpf 的斑馬魚胚胎的 PCV 區(qū)域中高度表達(dá)，與之前的報告一致。因此，par1可能參與斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的淋巴管發(fā)育。為了研究這一點(diǎn)，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地構(gòu)建了一個斑馬魚par1突變體，該突變體在其第2外顯子中含有103 bp的缺失。我們發(fā)現(xiàn)突變體的F2代胚胎似乎是正常的，沒有任何嚴(yán)重缺陷。然而，在5 dpf時，他們顯示TD形成受損。正常只有 6% 的體細(xì)胞缺乏 TD。 相比之下，par1斑馬魚突變體中近25%的體細(xì)胞缺乏TD。此外，突變體平均只有 11.2 個 LEC 核/6 個體節(jié)，明顯少于同胞胚胎中的 17.5 個。總之，這些結(jié)果證實(shí)了 par1 是 TD 形成所必需的，這意味著它在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中參與了軀干淋巴的發(fā)育。

圖1、par1突變斑馬魚胚胎顯示TD形成缺陷

par1調(diào)節(jié)斑馬魚淋巴祖細(xì)胞的分化：在斑馬魚的淋巴管發(fā)育過程中，Prox1a陽性內(nèi)皮細(xì)胞在30hpf時從PCV背面出現(xiàn)，在48hpf時形成PLs作為淋巴祖細(xì)胞池。同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞并行生長形成靜脈節(jié)段間血管（vISV），然后與動脈節(jié)段間血管（aISV）融合，建立具有交替動脈和靜脈連接的循環(huán)網(wǎng)絡(luò)。為了確定 par1 是否參與淋巴分化，我們首先進(jìn)行了全胚胎免疫染色測定，以檢查 54 hpf 時 Tg（fli1a：EGFP）系 PLs 中 Prox1a 的表達(dá)。與正常胚胎相比，par1斑馬魚突變體在PLs中表現(xiàn)出prox1a表達(dá)減少。伴隨著par1在斑馬魚胚胎中調(diào)節(jié)prox1a表達(dá)的作用，我們使用siRNA方法下調(diào)了par1在人類真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（HDLEC）中的表達(dá)。有趣的是，PROX1的表達(dá)不僅在mRNA水平上顯著降低，而且在蛋白質(zhì)水平上也顯著降低。這些結(jié)果表明PAR1在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)PROX1表達(dá)中具有保守作用。為了確定par1是否在早期參與靜脈和淋巴管出現(xiàn)，我們將par1突變體與Tg（lyve1b:dsRed；flk1:EGFP）系雜交，其中l(wèi)yve1b:dsRed標(biāo)記靜脈和淋巴管。正常胚胎在36 hpf時，幾乎100%的靜脈和淋巴從PCV中出現(xiàn)，而par1突變體在同一階段僅顯示約80%出現(xiàn)。總之，這些結(jié)果表明par1是斑馬魚胚胎中淋巴祖細(xì)胞分化所必需的。

圖2、par1是斑馬魚胚胎淋巴分化所必需的

gnai2a是斑馬魚胚胎軀干淋巴管發(fā)育的選擇性必需物質(zhì)：許多不同的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合G蛋白α亞單位作為PAR1的下游效應(yīng)器發(fā)揮作用，包括GI、Gq/11和G12/13亞家族的成員。為了尋找參與斑馬魚胚胎par1介導(dǎo)的淋巴管生成的替代G蛋白，我們首先使用來自不同亞類的七種G蛋白（包括GNAQ、GNA11、GNA12、GNA13、GNAI1、GNAI2和GNAI3）對HDLEC進(jìn)行定量實(shí)時PCR（qPCR）分析。我們發(fā)現(xiàn)只有GNA11、GNA13和GNAI2具有相對較高的mRNA表達(dá)水平。然后，我們使用siRNA方法敲除HDLEC中這三個基因的表達(dá)，并驗(yàn)證PROX1的表達(dá)水平。令人驚訝的是，結(jié)果表明，僅敲除 GNAI2導(dǎo)致 PROX1 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平方面的表達(dá)顯著下降。這表明GNAI2比其他G蛋白更可能參與調(diào)節(jié)淋巴管分化。我們通過WISH分析了gnai2同源基因（gnai2a和gnai2b）在斑馬魚胚胎中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，gnai2a，但不是 gnai2b，在PCV 區(qū)域中高度表達(dá)。為了支持這一結(jié)果，我們隨后通過將 gna11a MO、gna11b MO、gna13a MO、gna13b MO 以及 gnai2a MO 注射到單細(xì)胞階段的胚胎中進(jìn)行了敲除分析。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)只有g(shù)nai2a變體表現(xiàn)出TD形成缺陷，超過50%的體節(jié)缺乏TDs。相反，對照胚胎和gna11a、gna11b、gna13a和gna13b變體顯示正常TD形成。這些結(jié)果表明，gnai2a是斑馬魚胚胎淋巴發(fā)育的選擇性必需物質(zhì)。

圖3、gnai2a是斑馬魚胚胎淋巴管發(fā)育的選擇性必需物質(zhì)

gnai2a重現(xiàn)了斑馬魚淋巴管發(fā)育過程中par1介導(dǎo)的表型：為了研究gnai2a在斑馬魚淋巴管生成過程中的作用，我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了一個gnai2a突變體，其外顯子3中有68 bp的缺失。大多數(shù)突變體的F2代在5dpf時表現(xiàn)為正常表型。接下來，我們檢測了胚胎發(fā)生過程中5 dpf時TD的形成。如圖 4 所示，近 30% 的體細(xì)胞在突變體中缺乏 TD，明顯多于正常胚胎。突變體的數(shù)量顯著減少，平均為11.7，而正常胚胎的平均為18.2。為了評估gnai2a是否需要調(diào)節(jié)淋巴管分化，我們在Tg（fli1a:EGFP）胚胎中使用54 hpf的抗Prox1抗體進(jìn)行了免疫染色分析。我們發(fā)現(xiàn)F2代突變體的prox1a陽性PLs比同胞胚胎少。同時，與正常對照胚胎相比我們發(fā)現(xiàn) gnai2a 的敲除導(dǎo)致 36 hpf 時淋巴-靜脈的出現(xiàn)部分失敗。 這表明gnai2a是斑馬魚淋巴管分化所必需的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證gnai2a在這個過程中是par1的下游效應(yīng)子，我們使用Tg（fli1a:EGFP）系和Tg（fli1aep:dsRed；fli1:nEGFP）系雜交par1雜合突變體和gnai2a雜合突變體。我們發(fā)現(xiàn)野生型胚胎、par1雜合子突變體、gnai2a雜合子突變體和雜交的par1-gnai2a雜合子突變體具有正常的形態(tài)，并且在TD形成方面沒有表現(xiàn)出可比的差異。這表明在雜交的par1-gnai2a雜合子斑馬魚突變體中，par1和gnai2a之間存在遺傳相互作用，尤其是在細(xì)胞水平上。

圖 4. gnai2a 突變體模擬 par1 突變體中觀察到的淋巴表型

凝血酶不參與斑馬魚淋巴管生成：F2 是第一個被報道能夠在典型位點(diǎn)切割和激活 PAR1 的配體。為了闡明斑馬魚胚胎淋巴管發(fā)育是否需要F2，我們在單細(xì)胞階段將F2-MO注入胚胎。在5dpf時，我們分析了TD的形成，意外地發(fā)現(xiàn)對照和F2變體都有正常的TD形成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們用 SCH79797 處理斑馬魚胚胎，SCH79797 是一種特定的 PAR1 拮抗劑，可阻斷 F2 和 PAR1 之間的相互作用。與上述結(jié)果一致，在5dpf時，處理過的胚胎和賦形劑對照胚胎均表現(xiàn)出正常的TD形成，這表明par1在調(diào)節(jié)斑馬魚淋巴管發(fā)育方面獨(dú)立于F2。這些結(jié)果清楚地表明，斑馬魚淋巴管發(fā)育不需要F2。

斑馬魚淋巴管發(fā)育需要mmp13b：幾種蛋白酶切割并激活PAR1，包括F2、纖溶酶、活化蛋白C、血小板素、Xa因子、VIIa因子、類胰蛋白酶、胰蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等。為了尋找參與PAR1調(diào)節(jié)斑馬魚淋巴管生成的候選蛋白酶，我們首先對HDLEC進(jìn)行了qPCR分析，并觀察了這些蛋白酶的相對mRNA表達(dá)。有趣的是，MMP1的相對mRNA表達(dá)最高。接下來，我們將MMP1 siRNA轉(zhuǎn)染到HDLEC中，并評估PROX1的表達(dá)。有趣的是，MMP1的敲除導(dǎo)致PROX1 mRNA表達(dá)顯著降低，表明MMP1可能參與淋巴管生成。在人類基因組中，有三種膠原酶（MMP1、MMP8和MMP13）。然而，其中兩個（Mmp1和Mmp8）沒有斑馬魚同源物，在斑馬魚基因組中只有MMP13存在重復(fù)（Mmp13a和Mmp13b）。mmp13a 在髓系細(xì)胞中表達(dá)，但不在靜脈中表達(dá)。因此，我們推測 mmp13b 可以替代人類 MMP1 基因的功能，調(diào)節(jié)par1介導(dǎo)的斑馬魚胚胎淋巴管發(fā)育。用WISH觀察斑馬魚胚胎發(fā)生過程中mmp13b的表達(dá)模式。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)它在26 hpf的PCV區(qū)域高度表達(dá)，表明它與淋巴管有關(guān)。我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生了一個斑馬魚mmp13b突變體，并獲得了一個穩(wěn)定的突變體，其外顯子4中有一個7bp的缺失。為了驗(yàn)證mmp13b在調(diào)節(jié)淋巴管生成中的作用，我們檢測了F2代胚胎中TD的形成。正如在par1斑馬魚突變體中觀察到的那樣，mmp13b突變體胚胎在5 dpf時顯示出近25%的體節(jié)缺乏TD。54 hpf下PLs中Prox1a表達(dá)的免疫染色分析表明，與正常胚胎相比，突變體也顯示出顯著降低的Prox1a表達(dá)。總之，這些數(shù)據(jù)表明mmp13b是斑馬魚淋巴管發(fā)育所必需的。

圖 5. mmp13b 突變體模擬 par1 突變體中觀察到的淋巴表型。

par1促進(jìn)斑馬魚胚胎Erk1/2活性和flt4表達(dá)：Vegfc 及其受體 Flt4 通過誘導(dǎo) prox1a 表達(dá)激活 p-Erk1/2，最終調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎淋巴祖細(xì)胞的分化。基于以上結(jié)果，我們提出par1可能促進(jìn)Vegfc/Flt4/Erk信號活性，從而調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎的淋巴管生成。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們使用 F2 代 Tg(fli1a:EGFP) 胚胎進(jìn)行了全胚胎 p-Erk1/2 免疫染色測定。在 28 hpf 時，當(dāng)淋巴祖細(xì)胞開始從 PCV 背側(cè)遷移時，我們在同胞胚胎的 PCV 中觀察到明顯的 p-Erk1/2 染色。然而，par1斑馬魚突變體的PCV染色明顯減少。接下來，為了證實(shí)PAR1是否促進(jìn)VEGFC誘導(dǎo)的p-ERK1/2激活，我們在培養(yǎng)的HDLEC中進(jìn)行了PAR1敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PAR1敲除導(dǎo)致VEGFR3 mRNA水平顯著降低。

圖6、par1功能喪失降低斑馬魚胚胎PCV中p-Erk1/2活性和flt4表達(dá)

局限性：在本研究中，我們產(chǎn)生了三個突變體，發(fā)現(xiàn)mmmp13b-par1-gnai2a軸調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎中淋巴祖細(xì)胞的分化。機(jī)制上，par1促進(jìn)后主靜脈flt4表達(dá)和磷酸化Erk1/2活性。然而，將mmp13b-par1-gnai2a通路與flt4調(diào)節(jié)聯(lián)系起來的機(jī)制需要進(jìn)一步擴(kuò)展。

原文出自：Noncanonical protease-activated receptor 1 regulates lymphatic differentiation in zebrafish - ScienceDirect