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摘要：硒是一種從日常飲食中提取的必需微量營養(yǎng)素，可維持脊椎動(dòng)物的正常生長發(fā)育。過量攝入硒會(huì)導(dǎo)致心血管毒性、生殖毒性和神經(jīng)毒性。然而，很少有人研究硒對(duì)神經(jīng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)行為的毒性作用。在這項(xiàng)研究中，用硒處理新受精的斑馬魚胚胎。0.5μM濃度的硒處理降低了斑馬魚胚胎的移動(dòng)速度和距離，并減弱了觸摸反應(yīng)。TUNEL 測定和免疫熒光分析表明，硒可誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)損傷，包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增殖和神經(jīng)炎癥，并減少斑馬魚胚胎中的神經(jīng)元。RNA-seq 和 RT-PCR 結(jié)果表明，硒處理顯著降低了斑馬魚胚胎中多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、GABA 能神經(jīng)元和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記基因的表達(dá)。在硒處理的胚胎中，PPAR信號(hào)通路標(biāo)記基因的表達(dá)顯著下調(diào)。測試了兩種 PPAR 激動(dòng)劑（羅格列酮和苯扎貝特）和一種抗癌藥物（順鉑）在減輕硒誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)缺陷方面的作用。羅格列酮和苯扎貝特可以恢復(fù)一些神經(jīng)標(biāo)記基因的表達(dá)，但不能完全挽救硒誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)行為缺陷。 補(bǔ)充順鉑可將功能失調(diào)的運(yùn)動(dòng)行為和PPAR和神經(jīng)標(biāo)記基因的異常表達(dá)恢復(fù)到幾乎正常水平。總之，本研究結(jié)果表明，硒誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)行為缺陷是由包括PPAR信號(hào)在內(nèi)的多種復(fù)雜因素引起的，所有因素都可能通過未知機(jī)制被順鉑恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：硒  斑馬魚  神經(jīng)發(fā)育   運(yùn)動(dòng)行為

簡介：硒通常被認(rèn)為是一種具有抗氧化和抗炎作用的微量元素。然而，最近的研究表明，過量硒對(duì)包括魚類、水生鳥類和兩棲動(dòng)物在內(nèi)的脊椎動(dòng)物有一定的毒性作用，這在包括美國、中國、加拿大和印度在內(nèi)的許多國家都有報(bào)道。硒主要存在于自然環(huán)境中的煤、地殼巖石和磷酸鹽土壤中。人類活動(dòng)加劇了水環(huán)境中的硒污染，如采礦、煉油、發(fā)電、農(nóng)業(yè)排水和含硒土壤上的畜牧業(yè)。在受硒污染的水環(huán)境中，硒的濃度通常在10μg L-1到68.7μg L-1（0.13–0.86μM）之間，遠(yuǎn)高于安全濃度。硒過量攝入會(huì)對(duì)脊椎動(dòng)物的神經(jīng)、免疫、心血管和生殖系統(tǒng)造成損害。我們之前的研究表明，硒蛋氨酸的積累可以延遲孵化并導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)一系列畸形。也有報(bào)道稱，膳食中補(bǔ)充硒代蛋氨酸可以改變成年斑馬魚的社交和抗驚厥行為。硒的毒性作用可能是由于其產(chǎn)生活性氧（ROS）的能力。 雖然中等濃度的硒具有一定的抗氧化作用，但過量的硒會(huì)破壞氧化還原平衡。例如，之前的一項(xiàng)研究報(bào)告稱，胚胎中微量注射硒可以改變氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)。一些研究表明，硒可以預(yù)防由多種重金屬和污染物（如氯氰菊酯、甲基汞和鎘）引起的神經(jīng)毒性。然而，關(guān)于過量硒的神經(jīng)毒性的研究很少。正常的運(yùn)動(dòng)行為需要神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉收縮的綜合功能，而從神經(jīng)系統(tǒng)釋放信號(hào)刺激肌肉收縮是主要原則，從無脊椎動(dòng)物到包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的脊椎動(dòng)物都是如此。多巴胺能神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是與運(yùn)動(dòng)行為相關(guān)的兩種主要神經(jīng)細(xì)胞類型。 多巴胺能神經(jīng)元負(fù)責(zé)釋放多巴胺作為一種神經(jīng)遞質(zhì)以支持正常的運(yùn)動(dòng)功能。據(jù)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)中樞多巴胺能神經(jīng)元的損傷導(dǎo)致帕金森病。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元負(fù)責(zé)將中樞神經(jīng)信號(hào)傳輸?shù)郊∪獠⒅淦浠顒?dòng)。 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷也會(huì)導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括原發(fā)性側(cè)索硬化、肌萎縮側(cè)索硬化和進(jìn)行性延髓麻痹。此外，從神經(jīng)元到神經(jīng)元以及從神經(jīng)元到效應(yīng)細(xì)胞的信息傳遞依賴于神經(jīng)遞質(zhì)，例如乙酰膽堿、γ-氨基丁酸 (GABA)、多巴胺和5-羥色胺。因此，維持正常的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞對(duì)于正常的運(yùn)動(dòng)行為也是必不可少的。神經(jīng)系統(tǒng)，特別是斑馬魚胚胎和仔魚的神經(jīng)系統(tǒng)，很容易受到外界環(huán)境的影響。 接觸污染物和藥物容易影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，損傷神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力缺陷。據(jù)報(bào)道，硒對(duì)5-羥色胺能神經(jīng)傳遞和多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)有重要影響，影響成年斑馬魚的社交和學(xué)習(xí)能力。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過量的硒會(huì)誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲的膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。然而，關(guān)于斑馬魚胚胎中過量硒引起的功能障礙運(yùn)動(dòng)行為的研究仍然很少。 過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPAR) 是一種非甾體核受體，在多種細(xì)胞類型和組織中表達(dá)并且在配體特異性和代謝途徑激活方面表現(xiàn)出差異。研究表明，PPARs參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能，激活PPARs可以有效緩解神經(jīng)功能障礙，提高運(yùn)動(dòng)能力。我們推測過量的硒可能通過破壞斑馬魚胚胎的早期神經(jīng)發(fā)育來影響運(yùn)動(dòng)行為，而 PPAR 信號(hào)可能與硒誘導(dǎo)的行為缺陷有關(guān)。首先檢測胚胎的觸覺反應(yīng)和運(yùn)動(dòng)行為，然后檢測大腦細(xì)胞的形態(tài)特征、凋亡和增殖。然后，通過qPCR和免疫熒光（IF）評(píng)估斑馬魚胚胎發(fā)生過程中神經(jīng)特異性細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞。此外，還測試了兩種PPAR（過氧化物酶體增殖物激活受體）激動(dòng)劑羅格列酮和苯扎貝特緩解硒誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)缺陷的效果。順鉑是一種廣泛使用的抗癌藥物，通常被認(rèn)為具有細(xì)胞毒性。然而，我們之前的研究表明，低劑量順鉑可以有效緩解硒誘導(dǎo)的眼部發(fā)育缺陷。因此，順鉑也被添加到硒處理的胚胎中以試圖挽救硒誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)缺陷。

圖 1 、硒暴露對(duì)96 hpf斑馬魚仔魚運(yùn)動(dòng)行為的影響。 對(duì)照、0.125?μM、0.25?μM 和 0.5?μM 硒處理組斑馬魚仔魚的移動(dòng)軌跡 (A)、距離 (B) 和速度 (C)。

硒誘導(dǎo)斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為功能失調(diào)：為了驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)行為缺陷的有效硒濃度窗口，受精斑馬魚胚胎暴露于不同濃度（0.125、0.25、0.5和1?μM）的硒中。然后，在對(duì)照組和硒處理組中檢測表型、死亡率和孵化率。隨著硒濃度的增加，胚胎死亡率增加，孵化率降低。當(dāng)硒濃度達(dá)到1?μM時(shí)，近50%的胚胎死亡，存活的胚胎也出現(xiàn)嚴(yán)重畸形。選取各組（對(duì)照組，0.125、0.25和0.5?μM）無明顯畸形的斑馬魚仔魚進(jìn)行行為分析。斑馬魚運(yùn)動(dòng)跟蹤顯示，與對(duì)照組相比0.5?μM硒處理的斑馬魚仔魚移動(dòng)距離明顯縮短，游泳速度較慢，而0.125和0.25?μM硒處理的斑馬魚仔魚在移動(dòng)速度和距離上沒有顯著差異。此外，在相同的觸摸刺激下，對(duì)照組、0.125和0.25?μM組的仔魚反應(yīng)更快，遠(yuǎn)離觸摸針。然而，0.5?μM硒處理組的仔魚對(duì)觸摸的反應(yīng)明顯遲鈍，有些甚至在幾次觸摸后都無法遠(yuǎn)離觸摸針。

硒損傷大腦細(xì)胞并誘導(dǎo)斑馬魚胚胎神經(jīng)炎癥：H&E染色顯示，與96 hpf時(shí)對(duì)照胚胎相比，硒處理胚胎的大腦切片中存在稀疏細(xì)胞。此外，透射電子顯微鏡（TEM）檢測顯示大腦中線粒體和核膜結(jié)構(gòu)的破壞。與對(duì)照組相比，硒處理的胚胎顯示線粒體內(nèi)膜減少（假紅色），產(chǎn)生大液泡，并形成松散和折疊的核膜結(jié)構(gòu)（用綠色箭頭標(biāo)記）。為了剖析硒誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的機(jī)制，用TUNEL法和IF檢測了胚胎大腦中的細(xì)胞凋亡和增殖。 結(jié)果顯示硒處理的胚胎大腦細(xì)胞凋亡增加。IF 表明硒處理的胚胎具有更多的磷酸化 H3 陽性細(xì)胞核。 此外，硒處理組的神經(jīng)炎癥標(biāo)志物蛋白表達(dá)顯著增加。

圖2、96 hpf斑馬魚胚胎大腦組織的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和增殖。（A） 對(duì)照組和硒處理組胚胎大腦橫截面的H&E染色分析。黃色矩形代表大腦部分的稀疏細(xì)胞。 (B) 斑馬魚胚胎大腦組織的 TEM 切片。 紅色代表受損的線粒體。綠色箭頭表示收縮變形的細(xì)胞核。B3-B4是B1-B2中標(biāo)記的紅色框的放大區(qū)域。(C) 通過 TUNEL 檢測 (紅點(diǎn)) 進(jìn)行細(xì)胞凋亡測定。 黃色矩形代表大腦中細(xì)胞凋亡的增加。(D) 用 pH3 (綠點(diǎn)) 抗體通過免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞增殖測定。 黃色矩形代表大腦細(xì)胞增殖增加。

圖3、在96 hpf時(shí)，硒激活了斑馬魚仔魚大腦中的神經(jīng)炎癥。（A） 經(jīng)硒處理的斑馬魚胚胎大腦切片的代表性IF圖像。GFAP（綠色）。黃色矩形代表星形膠質(zhì)細(xì)胞增多。（B） 經(jīng)硒處理的斑馬魚胚胎大腦切片的代表性IF圖像。Iba1（綠色）。黃色矩形代表小膠質(zhì)細(xì)胞增多。

硒影響神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞：RNA-seq用于評(píng)估過量硒對(duì)斑馬魚胚胎的影響。GO分析顯示，硒處理的胚胎中軸突發(fā)育、神經(jīng)元投射再生和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的轉(zhuǎn)錄水平顯著改變。定量PCR檢測多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物（sncgb、robo2和otpa）、GABA能神經(jīng)元標(biāo)記物（gad1b和gad2）和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記物（isl1、isl2a、insm1a和sox2）的表達(dá)。在受測基因中，經(jīng)硒處理的胚胎中sncgb、gad1b、gad2、isl1和isnsm1a表達(dá)下調(diào)。在 96 hpf 的對(duì)照和硒處理的胚胎中也確定了神經(jīng)遞質(zhì)傳遞標(biāo)記基因的表達(dá)。 結(jié)果表明，在測試的標(biāo)記基因中，slc6a6b、slc6a19a.1、slc6a19b、slc6a19a.2、slc6a18 和 slc6a2 在 96 hpf 硒處理的胚胎中表達(dá)下調(diào)，而 slc25a38 表達(dá)上調(diào)。此外，用抗NSE抗體通過免疫熒光檢查神經(jīng)元蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果表明，硒處理的胚胎中神經(jīng)元靶蛋白的表達(dá)下調(diào)。

圖 4、 硒處理96 hpf斑馬魚胚胎中神經(jīng)元相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)。(A) sncgb、robo2、otpa、gad1b 和 gad2 基因的表達(dá)（與多巴胺能和 GABA 能神經(jīng)元標(biāo)記有關(guān)）。 (B) 基因 isl1、isl2a、insm1a 和 sox2 的表達(dá)（與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記有關(guān)）。(C) 基因 slc6a6b、slc25a38a、slc6a19a.1、slc6a19b、slc6a19a.2、slc6a18 和 slc6a2 的表達(dá)（與神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性有關(guān)）。 (D) 用硒處理的斑馬魚胚胎大腦切片的代表性 IF 圖像。 NSE（綠色）。

PPAR信號(hào)參與硒誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)缺陷：為了揭示硒誘導(dǎo)胚胎缺陷的潛在機(jī)制，使用RNA序列進(jìn)行了KEGG富集分析。結(jié)果表明，硒處理組PPAR信號(hào)通路中富集的基因顯著下調(diào)。然后，通過qPCR評(píng)估相關(guān)基因（cd63、pparg、fabp6、slc27a4、fabp1b.1和fabp2）的表達(dá)。 與 RNA-seq 結(jié)果一致，與對(duì)照組相比，硒處理的96 hpf  時(shí)胚胎所有這些基因的表達(dá)均較低。選擇兩種 PPAR 激動(dòng)劑羅格列酮和苯扎貝特來評(píng)估 PPAR 信號(hào)傳導(dǎo)在硒誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)缺陷中的作用。 結(jié)果，羅格列酮上調(diào)了 cd36、fabp6 和 fabp1b.1 的表達(dá)，但下調(diào)了 pparg 和 slc27a4 的表達(dá)，并導(dǎo)致 硒處理 96 hpf胚胎中 fabp2 表達(dá)沒有顯著變化。然而，幾乎所有測試的 PPAR 信號(hào)標(biāo)記基因在 96 hpf 硒 +?苯扎貝特處理的胚胎中均上調(diào)。 在神經(jīng)標(biāo)記基因方面，在 96 hpf 硒處理的胚胎中，羅格列酮添加上調(diào)了 sncgb 和 gad1b 的表達(dá)，但下調(diào)了 gad2、isl1、slc25a38a 和 slc6a18 的表達(dá)。苯扎貝特添加上調(diào) sncgb 和 gad1b、gad2、isl1 的表達(dá)，但在 96 hpf 的硒處理胚胎中下調(diào) slc25a38a 和 slc6a18 的表達(dá)。還測量了羅格列酮和苯扎貝特組仔魚的觸覺反應(yīng)。結(jié)果表明，PPAR激動(dòng)劑雖然能恢復(fù)某些基因的表達(dá)，但不能明顯緩解硒引起的異常觸覺反應(yīng)。

圖 5、 羅格列酮和苯扎貝特對(duì)硒處理96 hpf斑馬魚胚胎中 PPAR 和神經(jīng)標(biāo)記基因表達(dá)的影響。

順鉑挽救了硒處理的斑馬魚胚胎的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)缺陷：在硒處理的胚胎中補(bǔ)充了一種眾所周知的抗癌藥物順鉑，以評(píng)估其對(duì)硒神經(jīng)毒性的影響。斑馬魚胚胎的行為分析表明，順鉑可以恢復(fù)硒處理胚胎的正常運(yùn)動(dòng)行為和觸覺反應(yīng)。此外，補(bǔ)充順鉑還能使硒處理胚胎中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞標(biāo)記基因的表達(dá)恢復(fù)到正常水平。此外，還發(fā)現(xiàn)順鉑在硒處理的胚胎中恢復(fù)了 PPAR 信號(hào)標(biāo)記基因的表達(dá)。進(jìn)行 ICP-MS 以確定順鉑是否影響硒的積累。 結(jié)果，添加順鉑并沒有改變胚胎中的硒含量。

圖 6、順鉑對(duì)斑馬魚胚胎硒誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)行為缺陷的影響。 對(duì)照、對(duì)照加順鉑、硒和硒加順鉑組 96 hpf 斑馬魚仔魚的移動(dòng)軌跡 (A)、距離 (B) 和速度 (C)。

圖7、順鉑對(duì)96 hpf硒處理斑馬魚胚胎PPAR和神經(jīng)標(biāo)記基因表達(dá)及硒含量的影響。

結(jié)論：這項(xiàng)研究表明，暴露于過量的硒會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)行為功能失調(diào)，包括移動(dòng)速度和距離降低以及對(duì)刺激的反應(yīng)遲鈍。過量硒可增加大腦細(xì)胞凋亡和增殖，并調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)。此外，補(bǔ)充 PPAR 激動(dòng)劑羅格列酮和苯扎貝特可以恢復(fù)一些神經(jīng)標(biāo)記基因的表達(dá)，但不能完全挽救硒處理胚胎的運(yùn)動(dòng)缺陷。順鉑可以恢復(fù)神經(jīng)和PPAR標(biāo)記基因的表達(dá)，恢復(fù)功能失調(diào)的運(yùn)動(dòng)行為。這項(xiàng)研究將有助于更好地了解斑馬魚體內(nèi)過量硒的神經(jīng)毒性。

原文出自：Excessive selenium affects neural development and locomotor behavior of zebrafish embryos - ScienceDirect