狠狠操伊人-狠狠操夜夜操-狠狠操夜夜-狠狠操婷婷-亚洲v国产v欧美v久久久久久-亚洲va在线

首先，研究人員對假手術(shù)和盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）構(gòu)建的膿毒癥小鼠的糞便進(jìn)行了2bRAD-M測序，以探索腸道微生物群與膿毒癥發(fā)生和發(fā)展之間的潛在聯(lián)系。 

在種水平上，與假手術(shù)組相比，CLP組的糞便中AKK豐度降低（圖1 A），隨后熒光定量PCR檢測中小鼠糞便中AKK的相對豐度也驗證這一發(fā)現(xiàn)（圖1 B）。重要的是，與小鼠模型一致，如圖1 C所示，61份膿毒癥患者糞便樣本的AKK豐度明顯低于27份對照樣本。為了闡明AKK在膿毒癥進(jìn)展中的作用，作者將高AKK和低AKK兩組人類糞便移植到受體小鼠中并進(jìn)行CLP手術(shù)。有趣的是，接受高AKK豐度糞便的小鼠的存活時間往往略高于接受低AKK的小鼠（圖1 E），盡管其他細(xì)菌也可能參與膿毒癥的進(jìn)展，但這些數(shù)據(jù)表明，AKK細(xì)菌至少在一定程度上發(fā)揮了保護(hù)作用。因此，腸道AKK水平可能參與膿毒癥的進(jìn)展。 

接下來，為了確定AKK對膿毒癥的直接影響，作者用PBS、活A(yù)KK或死AKK處理小鼠，然后進(jìn)行假手術(shù)或CLP手術(shù)。圖1 F-H提示，活A(yù)KK，而不是滅活A(yù)KK可以減輕膿毒癥引起的器官損傷和致死性。上述數(shù)據(jù)表明，AKK的保護(hù)作用可能取決于活細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)。然后，作者評估了來自活A(yù)KK的培養(yǎng)上清液是否能緩解膿毒癥。圖1 I-K提示，與對照相比，自活A(yù)KK的培養(yǎng)上清液可以減輕膿毒癥引起的器官損傷和致死性。LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中的數(shù)據(jù)同樣驗證了上述觀點（圖1 L-O）。總之，這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明，活的AKK可能通過產(chǎn)生保護(hù)性物質(zhì)，在小鼠模型中有效地挽救了致命性膿毒癥。 

圖1 腸道AKK在小鼠模型中對致命性膿毒癥具有保護(hù)作用[1] 

為了進(jìn)一步探索活A(yù)KK分泌的保護(hù)性物質(zhì)，作者對空白培養(yǎng)基和活A(yù)KK培養(yǎng)基的培養(yǎng)上清液進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一種新的三肽RKH在活的AKK上清液中顯著富集，并在非靶向代謝組學(xué)分析中表現(xiàn)出最大的倍數(shù)變化（圖2 C-D）。靶向驗證揭示RKH在活A(yù)KK培養(yǎng)基顯著高表達(dá)（圖2 E），且在膿毒癥病人中RKH含量顯著下降（圖2 H）。 

重要的是，作者引入賽業(yè)生物提供的無菌（germ free）小鼠并對其進(jìn)行AKK菌定植，發(fā)現(xiàn)AKK菌定植組小鼠中血漿和盲腸內(nèi)容物RKH含量顯著回升（圖2 F-G）。為了探索RKH對致命性膿毒癥的潛在治療作用，在CLP手術(shù)前/ LPS注射前給小鼠服用RKH，結(jié)果提示（圖2 I-O），AKK活性產(chǎn)物RKH可以在小鼠模型中預(yù)防致命性膿毒癥。 

圖2 活A(yù)KK產(chǎn)生的Arg-Lys-His（RKH）對小鼠致命性膿毒癥的保護(hù)作用[1] 

就細(xì)胞因子風(fēng)暴而言，系統(tǒng)性炎癥是膿毒癥發(fā)病期間死亡的主要因素之一。作者對Sham對照組，CLP組以及CLP+RKH處理組的小鼠腹腔灌洗液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果顯示RKH處理后，與CLP組相比其中全基因表達(dá)發(fā)生改變，且其中的炎癥因子表現(xiàn)下降趨勢（圖3 A-B）。進(jìn)一步的，研究人員發(fā)現(xiàn)活A(yù)KK，AKK培養(yǎng)上清以及RKH處理能夠明顯降低系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)以及腹腔巨噬細(xì)胞富集（圖3 C-G）。此外，細(xì)胞體外刺激的結(jié)果顯示RKH能夠降低LPS誘導(dǎo)的多種巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)。綜上，RKH可能通過抑制膿毒癥引起的系統(tǒng)性炎癥發(fā)揮保護(hù)作用。 

圖3 RKH預(yù)防膿毒癥引起的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[1] 

TLRs在膿毒癥進(jìn)展過程中對入侵病原體的系統(tǒng)反應(yīng)起著重要作用。圖4 A-B提示，RKH能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞中TLR4下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作者使用FITC熒光素標(biāo)記的LPS處理巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RKH能夠顯著抑制LPS的結(jié)合（圖4 C）。結(jié)合上述結(jié)果，作者猜測RKH能夠與LPS競爭性結(jié)合TLR4，并通過表面等離子共振技術(shù)（圖4 D），酶解實驗（圖4 E），熱穩(wěn)定實驗（圖4 F）和分子對接技術(shù)（圖4 I）驗證了此觀點。 

更重要的是，免疫沉淀（IP）實驗的數(shù)據(jù)顯示，RKH是通過抑制TLR4-MD2和TLR4-TLR4的二聚化來實現(xiàn)對TLR4下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制（圖4  G-H）。此外，根據(jù)分子對接結(jié)果提示的RKH結(jié)合位點進(jìn)行突變的實驗結(jié)果提示TLR4上的ARG264、LEU293、ASP294和LYS362可能是RKH抑制TLR4二聚的潛在功能結(jié)合位點。最后，作者引入TLR4-/-小鼠對上述觀點進(jìn)行驗證。小鼠進(jìn)行CLP手術(shù)后，RKH對生存率，臟器損傷和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)沒有保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，RKH對致命性膿毒癥的保護(hù)作用，至少部分是通過抑制TLR4信號傳導(dǎo)而發(fā)生的。 

圖4 RKH直接靶向TLR4并阻斷TLR4激活[1] 

為了進(jìn)一步擴(kuò)大RKH在臨床上治療膿毒癥的潛力，作者采用了巴馬豬膿毒癥大動物模型。圖5提示，在巴馬豬膿毒癥模型中，RKH處理能夠顯著延長生存率，降低血清中多種損傷指標(biāo)，緩解多臟器損傷以及減弱炎癥反應(yīng)。 

圖5 RKH延長膿毒癥巴馬豬模型的存活時間并減少過度炎癥和器官損傷[1] 

最后，為了進(jìn)一步評估RKH對人類免疫細(xì)胞促炎活性調(diào)節(jié)的效力，從膿毒癥患者中提取外周血單核細(xì)胞，并在體外分化為巨噬細(xì)胞。圖6 A提示，RKH能夠顯著降低巨噬細(xì)胞IL-6的mRNA水平。此外，RKH不影響膿毒癥患者淋巴細(xì)胞正常功能（包括凋亡和細(xì)胞因子產(chǎn)生）。 

圖6 RKH負(fù)調(diào)控膿毒癥患者巨噬細(xì)胞的促炎活性[1] 

綜上所述，該研究提供了膿毒癥發(fā)展背景下宿主-微生物群落的相互作用的新證據(jù)。作者通過揭示活A(yù)KK產(chǎn)生的一種新的生物活性三肽RKH，擴(kuò)展了活A(yù)KK的病理生理作用。如果在未來的臨床實踐中對膿毒癥能夠發(fā)揮保護(hù)作用，尤其是對處于高炎癥狀態(tài)的患者，RKH可能是致命性膿毒癥的潛在有效治療方法。