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基因組定點編輯技術ES細胞打靶技術和CRISPR/Cas9系統的技術路線?

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小鼠基因組定點編輯技術

ES細胞打靶

在小鼠胚胎干細胞(ES 細胞)中進行 DNA 同源重組,將 ES 細胞重新注射到囊胚腔中,可以形成嵌合胚胎,并能在假孕小鼠體內發育,最終發育為嵌合體小鼠。這種嵌合小鼠的組織細胞(包括生殖細胞)可以分別來自囊胚的細胞和被注射的ES細胞。因此,通過嵌合小鼠和野生型小鼠的交配,ES 細胞中的遺傳信息就能夠傳遞到后代的小鼠個體中。

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圖1. ES細胞打靶載體基本結構及原理(圖片來自內部資料)

利用ES細胞打靶技術建立基因修飾小鼠模型的主要技術路線:

(1)構建重組基因載體(正負雙向選擇系統)

(2)用電穿孔等方法把重組DNA轉入受體ES細胞內

(3)用選擇培養基篩選抗藥ES細胞,并利用PCR或或 Southern blot 等方法鑒定發生正確同源重組的ES細胞

(4)將中靶ES細胞注射到受體囊胚中,將注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宮中,讓其受孕,待小鼠出生后,通過觀察毛色的嵌合與否和嵌合程度判斷是否獲得嵌合體小鼠。

圖2. ES細胞打靶技術路線(圖片來自內部資料)

CRISPR/Cas9技術

CRISPR/Cas是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種高度保守的適應性免疫防御系統,可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。

CRISPR是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(規律成簇間隔短回文重復)的縮寫。CRISPR簇是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復序列家族,其序列由一個前導區(Leader)、多個短而高度保守的重復序列區(Repeat)和多個間隔區(Spacer)組成。

Cas則是在CRISPR附近的一個多態性家族基因,這個家族基因編碼的蛋白均含有可與核酸發生作用的功能域,并且與CRISPR區域共同發揮作用,因此被命名為CRISPR關聯基因(CRISPR associated),縮寫為Cas,包括Cas1~Cas10等多種類型。

當細菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時,在前導區的調控下,CRISPR被轉錄成pre-crRNA,然后被加工成一系列短的含有保守重復序列和間隔區的成熟crRNA,最終識別并結合到與其互補的外源DNA序列上發揮剪切作用。

圖3. 細菌CRISPR/Cas系統抵御外來入侵原理示意圖(圖片來自Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-78.)

目前在基因編輯應用最為廣泛的CRISPR/Cas9系統是以Cas9蛋白以及向導RNA(gRNA)為核心組成。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白質中部的HNH兩個活性位點,在crRNA成熟和雙鏈DNA剪切中發揮作用,引起DNA雙鏈斷裂。CRISPR/Cas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(Protospacer Adjacent Motif)的NGG位點,這種特征的序列在每128bp的隨機DNA序列中就重復出現一次。

圖4. CRISPR/Cas9基本結構原理示意圖(圖片By Mariuswalter - Own work, CC BY-SA 4.

DNA雙鏈斷裂后,在不存在同源模板的情況下發生非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)修復斷裂DNA。通常在Cas9剪切位點附近造成小片段堿基的插入或缺失。如果隨機修復發生在基因的編碼外顯子中,則往往會導致讀碼框發生移碼突變,最終使靶基因無法正常轉錄翻譯。當DNA斷裂后,細胞核內同時存在與損傷DNA同源的DNA片段,那么則可通過同源介導的雙鏈DNA修復(Homology directed repair ,HDR)在目的位點引入外源DNA片段,從而達到片段敲入或編輯的效果。

圖5. 利用DNA雙鏈斷裂修復實現基因定點編輯原理示意圖(圖片來自Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-78. )

利用CRISPR/Cas9系統的這些特性,CRISPR/Cas9途徑獲得基因修飾小鼠模型的主要技術路線:

(1)我們可以針對基因組特定序列設計向導RNA(gRNA)

(2)體外轉錄gRNA以及編碼Cas9蛋白的mRNA

(3)將gRNA、Cas9 mRNA注射到小鼠受精卵中

(4)注射后的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管中,受精卵發育成F0代小鼠。

圖6. CRISPR/Cas9途徑獲得基因修飾小鼠模型的技術路線(圖片來自內部資料)

擴展閱讀——正負雙向選擇系統 (positive-negative-selection, PNS)

由于高等真核細胞內外源DNA與靶細胞DNA序列自然發生同源重組的機率非常低,約為百萬分之一,要把基因敲除成功的細胞篩選出來是一件非常困難的工作。因此,需要借助一些篩選標記來解決這一關鍵問題。

“+” 正篩選標記:通常是藥物抗性基因,最常用的就是Neo(新霉素抗性基因)。通過構建打靶載體,將帶有目的片段的外源DNA序列連同正篩選基因 neo 通過 DNA 序列間的同源重組替代基因組中需要敲除或修飾的片段,達到敲除或敲入特定基因的目的。正篩選基因 neo的表達賦予重組 ES 細胞具有抵抗細胞毒性藥物 G418的特性,使細胞在藥物篩選下存活并形成細胞克隆。

“-” 負篩選標記:為減少因隨機插入產生的藥物抗性克隆對篩選的干擾,可以在打靶載體同源重組區域的外側加上負篩選基因,通常是細胞毒性相關基因。例如來自皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因,該基因可以將對細胞無毒的核苷類似物 Ganc 進行磷酸化,從而產生對細胞有毒的核苷酸類似物。 當打靶載體在細胞內進行同源重組時,TK 基因由于在同源重組區域的外側,因此不會整合到細胞染色體上,隨著細胞的生長和分裂 TK 基因發生自然降解和稀釋,從細胞中消失。因此這類細胞不會因為 Ganc 的存在而死。但如果發生打靶載體隨機插入整合到 ES 細胞染色體上的情況,那么TK 基因很可能也會同時整合上去,結果導致這類非正確同源重組的ES細胞在 Ganc 的存在下生成有毒的核苷酸類似物而致死。

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