編者：資源增量是實(shí)驗(yàn)動物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實(shí)驗(yàn)動物對生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀(jì)80年代以來，我國老一輩實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)家苦心孤詣，在實(shí)驗(yàn)動物資源研發(fā)工作中取得了多項(xiàng)開創(chuàng)新成果。
1988年《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動物和動物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實(shí)驗(yàn)動物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
非人靈長類模式動物
非人靈長類動物為社群性動物，具有明顯的社會等級關(guān)系和復(fù)雜的行為活動，相對于常用的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物，非人靈長類在生理、解剖、行為和生物醫(yī)學(xué)特性上更接近于人類，是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究中的高級實(shí)驗(yàn)動物，在人類疾病防控的疫苗研制研發(fā)、人類腦功能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中具有其他實(shí)驗(yàn)動物難以替代的作用。隨著對人類醫(yī)藥和健康研究的深入，低等模式動物在一些領(lǐng)域已經(jīng)不能滿足研究的需要，迫切需要建立諸如猴等進(jìn)化上與人類更接近的動物模型。
一、非人靈長類模式動物構(gòu)建技術(shù)發(fā)展簡史和面臨的問題
哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)依賴于輔助生殖和胚胎操作。小鼠上早在上個世紀(jì)80年代就已經(jīng)建立基因原核注射的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基于胚胎干細(xì)胞的基因敲出和敲入技術(shù)。這不僅僅是因?yàn)樾∈笫亲畛Ｓ玫膶?shí)驗(yàn)動物，早在上個世紀(jì)初就培養(yǎng)了大量遺傳背景一致的近交系，還因?yàn)樾∈缶哂卸嗵ド?、性成熟和繁殖周期短等天然?yōu)勢。而最為廣泛使用的非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物食蟹猴和恒河猴不僅遺傳背景復(fù)雜，且為有月經(jīng)周期的單胎生殖，即每個月經(jīng)周期排卵1-2枚，而其性成熟時間更是長達(dá)4年以上，加上近半年的懷孕期（約160-170天），這樣整個繁殖周期要在5年以上，同時，目前也沒有得到可生殖系傳代的胚胎干細(xì)胞。在胚胎資源有限和低繁殖能力這一天然劣勢的限制下，非人靈長類模式動物構(gòu)建技術(shù)進(jìn)展相對緩慢。2001年，美國俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)的Schatten教授團(tuán)隊(duì)利用高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體成功將外源基因?qū)牒愫雍锏呐咛?，獲得了世界上首只轉(zhuǎn)基因靈長類動物ANDi（意指inserted DNA），雖然在其得到的3只出生個體中僅有1只檢測到了外源基因GFP的整合和嵌合表達(dá)，但這一開創(chuàng)性的工作標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因非人靈長類技術(shù)的誕生。同年7月，Wolfgang 等同樣利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染恒河猴囊胚期胚胎后移植，也得到了在胎盤組織中整合了外源eGFP的轉(zhuǎn)基因恒河猴。這兩個開創(chuàng)性的工作說明轉(zhuǎn)基因非人靈長類技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從理想到現(xiàn)實(shí)的轉(zhuǎn)變。他們都選擇綠色熒光蛋白作為轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因，其主要目的還是用來探討轉(zhuǎn)基因非人靈長類技術(shù)的可行性。在這些工作發(fā)表7年后，美國佐治亞州亞特蘭大埃默里大學(xué)Anthony Chan團(tuán)隊(duì)于2008年報(bào)道利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)得到了世界上首批亨延頓舞蹈癥轉(zhuǎn)基因恒河猴。亨廷頓疾病是一種顯性的神經(jīng)性病變疾病，主要是因?yàn)槿撕嗤㈩D基因 (HTT) 第一個外顯子中CAG重復(fù)擴(kuò)增，導(dǎo)致表達(dá)的亨廷頓蛋白中含有多聚谷氨酰胺，從而引發(fā)運(yùn)動機(jī)能損傷、認(rèn)知功能退化和精神失調(diào)等一系列病癥，患者發(fā)病10?15年后就會死亡。雖然也有亨廷頓疾病嚙齒類轉(zhuǎn)基因動物模型，但這些模型都不能很好地模擬亨廷頓疾病在人體的表型特征。在亨廷頓轉(zhuǎn)基因恒河猴的工作中，作者把人HTT基因的第 一個外顯子上后面鏈接84個CAG重復(fù)序列，并把這段重組序列包裝到慢病毒載體中，得到高滴度的慢病毒顆 粒 (滴度>109PFU/mL)。通過卵母細(xì)胞透明帶下注射把病毒粒子注射到恒河猴MI期卵母細(xì)胞的卵周隙。之后，再通過單精注射讓卵母細(xì)胞受精和胚胎移植，成功得到轉(zhuǎn)基因恒河猴。分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因猴不僅表達(dá)了外源基因， 而且出現(xiàn)了神經(jīng)纖維網(wǎng)聚集、核內(nèi)含物，同時，表現(xiàn)出肌無力和舞蹈癥等亨廷頓舞蹈癥病人的典型標(biāo)志表型。作為第一個非人靈長類疾病動物模型，亨廷頓疾病轉(zhuǎn)基因恒河猴模型的意義之大是不言而喻的。該模型可以讓人們更好、更深入地了解亨廷頓疾病，研究其發(fā)病機(jī)制和致病機(jī)理，從而研發(fā)出相對應(yīng)的治療方案和藥物。同時，該模型的建立也證明了構(gòu)建其他非人靈長類疾病模型的可行性。其后，2009年日本科學(xué)家Sasaki等利用絨猴性成熟時間相對較短的特性，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功得到了可生殖系傳遞的GFP轉(zhuǎn)基因絨猴。我國雖然在非人靈長類輔助生殖和轉(zhuǎn)基因技術(shù)上起步較晚，2008 年華東師范大學(xué)報(bào)道了國內(nèi)首例試管食蟹，這足足比美國晚了24年（第一只試管猴出生于1983年），但經(jīng)過近10年的發(fā)展已經(jīng)逐漸趕上并超過了美國、日本等國，處于領(lǐng)跑地位。
在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因猴構(gòu)建工作上，2010 年中國科學(xué)院昆明動物研究所報(bào)道了國內(nèi)首例轉(zhuǎn)基因猴；2016年中科院神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長類研究平臺孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)與仇子龍組報(bào)道了用慢病毒轉(zhuǎn)染方法將人的自閉癥相關(guān)致病基因MeCP2成功轉(zhuǎn)入食蟹猴個體得到了多只有類似人類自閉癥表型的轉(zhuǎn)基因食蟹猴，并利用靈長類研究平臺首創(chuàng)的猴精巢異種移植技術(shù)提早得到了轉(zhuǎn)基因猴的F1代。通過慢病毒載體介導(dǎo)得到的非人靈長類轉(zhuǎn)基因技術(shù)只能完成外源基因的過表達(dá)操作，致其應(yīng)用范圍有限。由于在非人靈長類上還未建立可生殖系整合的猴胚胎干細(xì)胞系，因此還不能像通過胚胎干細(xì)胞基因打靶操作獲得基因敲除小鼠模型那樣來構(gòu)建基因敲除猴模型。隨著人工核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)，尤其是高效的CRISPR-Cas9核酶的出現(xiàn)，使得我們可以跨過非人靈長類無胚胎干細(xì)胞用于進(jìn)行同源重組基因打靶的這一技術(shù)障礙，直接通過早期猴胚胎注射用于靶向特定基因的分子核酶對靶基因進(jìn)行編輯，進(jìn)而獲得相應(yīng)靶基因突變的猴模型，這使得非人靈長類基因編輯成為了可能。
2014年，來自昆明理工大學(xué)和中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所的兩個團(tuán)隊(duì)分別通過受精卵注射靶向食蟹猴Mecp2基因的TALEN質(zhì)粒和mRNA得到了Mecp2 基因突變食蟹猴。 隨后南京大學(xué)、南京醫(yī)科大學(xué)和昆明理工大學(xué)聯(lián)合報(bào)道了使用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了基因編輯的食蟹猴。該工作通過將針對Ppar-γ、Rag1 和Nr0b1三個基因的5條sgRNA和Cas9 mRNA混合注入食蟹猴受精卵的卵胞質(zhì)并將注射后的胚胎移植到代孕受體，最后得到了Ppar-γ 和 Rag1基因編輯食蟹猴。之后，來自中國的多個實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了多種不同的基因編輯猴，而日本科學(xué)家利用ZFN和TALEN成功獲得了IL2RG基因編輯絨猴。至此，過表達(dá)和基因編輯這兩項(xiàng)主要的模式動物構(gòu)建技術(shù)在非人靈長類的主要物種恒河猴、食蟹猴和絨猴上都獲得了成功。
二、如何實(shí)現(xiàn)非人靈長類模式動物構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化
然而，慢病毒載體介導(dǎo)外源轉(zhuǎn)基因通常是以多位點(diǎn)多拷貝整合的方式整合到宿主基因組中，而通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建的首建猴個體多數(shù)為嵌合體突變，這導(dǎo)致我們很難得到基因型一致的轉(zhuǎn)基因或基因編輯首建個體。而這種基因型的多變，也使得我們很難精確地將轉(zhuǎn)基因或目的基因突變和潛在表型對應(yīng)起來。因此，利用這些方法得到的首建猴并不能稱之為標(biāo)準(zhǔn)的動物模型。
為了有效解決這一問題，建立基于體細(xì)胞核移植的非人靈長類模式動物構(gòu)建技術(shù)成為了必然。這是因?yàn)樵诤艘浦睬?，可對體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或（和）基因編輯操作以得到含有目的基因修飾的細(xì)胞，在將基因修飾后的細(xì)胞作為供體核進(jìn)行核移植，就可得到一批遺傳背景一致的基因修飾克隆動物。然而，這一技術(shù)建立的前提是首先攻克非人靈長類的體細(xì)胞核移植技術(shù)，并得到健康的克隆猴個體。
自1996年，首個體細(xì)胞核移植哺乳動物多莉羊出生以來，利用該技術(shù)已經(jīng)得到了包括馬、牛、羊、豬和駱駝等在內(nèi)大型家畜，也得到了包括小鼠、大鼠、兔、貓和狗在內(nèi)的多種實(shí)驗(yàn)動物。非人靈長類體細(xì)胞核移植的研究工作從2002年就開始有報(bào)道，盡管有國內(nèi)外多家機(jī)構(gòu)不斷嘗試，但是這些研究最終都沒有成功得到體細(xì)胞核移植來源的克隆猴。2003年，美國匹茲堡醫(yī)學(xué)院Schatten教授操作了700枚猴卵，并移植16只受體，沒能得到一只懷孕受體。2007年美國俄勒岡國家靈長類研究中心教授Mitalipov接受采訪時指出，他前后共利用了15000枚卵母細(xì)胞用于克隆猴實(shí)驗(yàn)，但得到的最好結(jié)果也僅僅是懷孕81天后的流產(chǎn)組織。國內(nèi)外多家頂級實(shí)驗(yàn)室在此領(lǐng)域連續(xù)受挫，使得科學(xué)家們逐漸失去了對該領(lǐng)域繼續(xù)攻關(guān)的信心。之前的體細(xì)胞克隆猴研究之所以一直沒有獲得成功，主要有兩方面的原因。一是非人靈長類體細(xì)胞核移植技術(shù)要求高，無論是卵母細(xì)胞去核還是體細(xì)胞的注入，靈長類核移植技術(shù)操作難度遠(yuǎn)高于目前已經(jīng)成功的其他哺乳動物。二是，克隆胚胎發(fā)育效率低，靈長類體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他哺乳動物。
為了建立非人靈長類體細(xì)胞核移植技術(shù)并得到健康存活的克隆猴，中科院神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長類研究（蘇州）平臺孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)經(jīng)過多年積累，熟練的掌握并改進(jìn)了猴體細(xì)胞核移植的一系列顯微操作技巧，同時針對多種能夠提升哺乳動物體細(xì)胞核移植效率的方法，進(jìn)行了逐一驗(yàn)證并篩選得到了可以明顯提升猴體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育效率的方法，在聯(lián)合使用組蛋白（H3K9me3）去甲基化酶Kdm4d和去乙酰化酶抑制劑TSA的條件下，成功將食蟹猴體細(xì)胞克隆胚胎的體外囊胚發(fā)育率從13.8%提升到了44.7%，同時囊胚的質(zhì)量也有了顯著的提高。在此基礎(chǔ)上，以胎猴成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞，進(jìn)行了克隆猴胚胎構(gòu)建和移植，成功得到了世界上首批健康存活 的體細(xì)胞克隆猴“中中”和“華華”。此項(xiàng)技術(shù)突破為非人靈長類模式動物構(gòu)建提供了重要的技術(shù)支持，被《Cell》 雜志主編Emilie Marcus稱贊為“生物技術(shù)領(lǐng)域近20年來的里程碑事件”。
體細(xì)胞克隆技術(shù)的建立對于開展非人靈長類基因編輯動物模型研究至關(guān)重要。首先，在體細(xì)胞上可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的遺傳操作；其次，通過嚴(yán)格篩選可去除脫靶；最后，可在一個孕周期（160天）內(nèi)獲得遺傳背景和基因型都一致遺傳修飾猴，這也有效克服了非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物無遺傳背景一致的近交系和傳代時間過長的問題，使得非人靈長類遺傳修飾動物稱為真正意義上可以廣泛應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化的模式動物。
三、非人靈長類模式動物的應(yīng)用前景
針對特定遺傳相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型可以讓科學(xué)家更好的理解疾病發(fā)生發(fā)展的過程和機(jī)制。如在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病和帕金森病的動物模型構(gòu)建中，由于嚙齒類動物在認(rèn)知和行為上與靈長類的巨大差異，使其在病理學(xué)與行為學(xué)特征的模擬以及藥物療效評價等方面都存在著無法彌補(bǔ)的缺陷，這也在一定程度上延緩了神經(jīng)退行性疾病的研究和藥物研發(fā)進(jìn)程。借助于非人靈長類動物模型來研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病有望在較大程度上彌補(bǔ)這些缺陷。在生殖與健康領(lǐng)域，非人靈長類中的食蟹猴和恒河猴都是有月經(jīng)周期的實(shí)驗(yàn)動物，且其平均周期也是28天，在月經(jīng)周期內(nèi)的生殖相關(guān)調(diào)控激素如促卵泡素、促黃體生成素、雌二醇和孕激素等的表達(dá)時相和變化規(guī)律與人類高度相似，因此是研究生殖內(nèi)分泌調(diào)控的最理想實(shí)驗(yàn)動物模型。此外，恒河猴和食蟹猴都有較長的青春期，也是用于研究青春期啟動和調(diào)控機(jī)制的理想動物模型。
隨著免疫療法在腫瘤患者的治療中產(chǎn)生了非常好的療效，伴隨而來的免疫因子風(fēng)暴和腦水腫等副作用也成為不可回避的問題，而小鼠模型很難模擬這些病理進(jìn)程，今年初在cancer discovery上的一篇報(bào)道，用恒河猴模型成功模擬了CAR-T處理后的免疫因子風(fēng)暴和腦水腫癥狀，因此可以預(yù)見，在不就的將來非人靈長類模式動物將在這個領(lǐng)域也發(fā)揮重要作用。此外諸如HIV，Ebola，Zika等感染性疾病的防控及疫苗研發(fā)也離不開非人靈長類模式動物，類似糖尿病、高血壓等慢性疾病，發(fā)病時間長，也同樣需要有較長壽命的非人靈長類動物模型。而通過結(jié)合基因編輯和體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化的非人靈長類模式動物，必將在這些研究領(lǐng)域發(fā)揮重要做成，從而更好地促進(jìn)人類健康事業(yè)發(fā)展。
參考文獻(xiàn)
[1]Chan AW, Chong KY, Martinovich C, et. al. Science. 2001; 291:309–12.
[2]Yang SH, Cheng PH, Heather B, et. al. Nature. 2008; 453:921–25.
[3]Liu Z, Cai YJ, Sun Q. Chin J Biotech, 2017, 33(10):1665–1673.
[4]Liu Z, Li X, Zhang JT, et al.Nature, 2016, 530(7588):98–102.
[5]Niu YY, Shen B, Cui YQ, et al. Cell, 2014, 156(4):836–843.
[6]Sun Q, Dong J, Yang WT, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(35):12956–12960.
[7]Sasaki E, Suemizu H, Shimada A, et al. Nature, 2009, 459(7246):523–527.
[8]Liu Z, Zhou X, Zhu Y, et al. Neurosci Bull, 2014, 30(3):381–386.
[9]Liu Z, Nie YH, Zhang CC, et al. Cell Res, 2016, 26(1):139–142.
[10]Liu Z, Cai YJ, Wang Y, et al., 2018, Cell 172, 881–887
[11]Taraseviciute A, Tkachev V, Ponce R, et. al. Cancer Discov. 2018 Jun;8(6):750-763.
17312606166