編者：資源增量是實(shí)驗(yàn)動物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實(shí)驗(yàn)動物對生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保 障。自上世紀(jì) 80 年代以來，我國老一輩實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)家苦心孤詣，在實(shí)驗(yàn)動物資源研發(fā)工作中取得的多項(xiàng)開創(chuàng)新成果。
1988年《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動物和動物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品 系開發(fā)和動物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實(shí)驗(yàn)動物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
斑馬魚的科研應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)化研究
謝訓(xùn)衛(wèi)，潘魯湲，熊鳳，李闊宇，柳力月，張昀，李玲璐，孫永華
中國科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家斑馬魚資源中心，武漢 430072
自上世紀(jì) 90 年代斑馬魚被引入中國實(shí)驗(yàn)室以來，斑馬魚相關(guān)研究在中國呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，現(xiàn)已成為繼美國之后的全球第二大斑馬魚研究大國。國內(nèi)已經(jīng)有超過 500 個以上的研究團(tuán)隊(duì)在以斑馬魚為工具開展科研工 作，涵蓋了生命科學(xué)，健康科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等眾多研究領(lǐng)域。斑馬魚全基因組測序自 2011 年啟動以來，已發(fā)布了 11 個拼接版本，斑馬魚基因組與人類基因組擁有較高的同源性，可以利用斑馬魚為工具進(jìn)行人類疾病的 病理學(xué)研究，構(gòu)建疾病模型。中國目前保存有超過 13 個實(shí)驗(yàn)動物物種，斑馬魚是其中發(fā)展最快的一個模式生物，它的標(biāo)準(zhǔn)化研究顯得尤為重要。斑馬魚等水生魚類目前尚只有地方標(biāo)準(zhǔn)可循，國家斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center, 簡稱CZRC）將有助于斑馬魚品系資源的標(biāo)準(zhǔn)化，著眼于現(xiàn)有品系資源的整合， 開發(fā)新品系和相關(guān)技術(shù)，促進(jìn)資源的優(yōu)化配置和共享服務(wù)。
關(guān)鍵詞：斑馬魚，標(biāo)準(zhǔn)化研究，國家斑馬魚資源中心，資源，技術(shù)，服務(wù)
1、斑馬魚的主要生物學(xué)特性
斑馬魚是一種原產(chǎn)于印度半島和孟加拉國的熱帶淡水魚類。在 20 世紀(jì) 70 年代，George Streisinger 首 次利用單體誘變技術(shù)建立純合斑馬魚品系(Streisinger, 1981)。這一時期，斑馬魚主要用于脊椎動物的發(fā)育研究。到了 90 年代，分別在德國和美國啟動的大規(guī)模 ENU 誘變，產(chǎn)生了上千個對胚胎早期發(fā)育產(chǎn)生影響的突 變品系，奠定了斑馬魚作為模式生物的基礎(chǔ)。
斑馬魚屬于硬骨魚類，作為一種優(yōu)良的低等脊椎動物模式生物，優(yōu)勢眾多。首先斑馬魚全基因組測序已經(jīng)完成，和人類基因組的相似度超過87%，71%的人類基因可以在斑馬魚基因組上找到同源基因，因此可以利用 斑馬魚為工具進(jìn)行人類疾病的病理學(xué)研究。目前已知的 3000 多個人類疾病相關(guān)基因有 82%可以在斑馬魚基因組中有同源基因，可以利用斑馬魚構(gòu)建各種疾病模型，并以此進(jìn)行藥物篩選(Howe et al., 2013; R, 2013)。
斑馬魚可以四季產(chǎn)卵，每周可產(chǎn)卵數(shù)百枚，繁殖力非常高，這是其他實(shí)驗(yàn)動物所無法比擬的，這也使得以斑馬魚胚胎為工具開展高通量高內(nèi)涵的藥物篩選工作成為一種新趨勢。
斑馬魚胚胎發(fā)育十分迅速，大約 24 小時就可以完成早期發(fā)育，此外斑馬魚進(jìn)行體外受精，整個發(fā)育過程在體外進(jìn)行，并且其胚胎在早期是透明的，這將有助于我們進(jìn)行活體原位觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。它們的器官具有與人類相同的主要特征，成為研究人類的發(fā)育過程的優(yōu)良模型。這些特性使斑馬魚在一些應(yīng)用上明顯優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)動物，尤其是哺乳動物的胚胎一般在體內(nèi)發(fā)育，無法對其進(jìn)行實(shí)時跟蹤觀察。
斑馬魚的體型很小，易于養(yǎng)殖，成本相對較低，它們的養(yǎng)殖模式可以比較容易進(jìn)行復(fù)制，這也是越來越多的科研工作者使用斑馬魚進(jìn)行研究工作的重要原因之一。
2、斑馬魚的科研應(yīng)用
斑馬魚的優(yōu)勢出眾，是全球眾多模式生物中發(fā)展最快的，增長速度甚至趕超小鼠，以斑馬魚為工具進(jìn)行的研究呈現(xiàn)快速增長的趨勢(Stewart et al., 2014; Xiong et al., 2018)。
斑馬魚胚胎獲取十分容易，針對胚胎的基因操作技術(shù)發(fā)展較為成熟，通過注射DNA，引入外源基因或標(biāo)記基因在體內(nèi)表達(dá)，或采用特異性啟動子實(shí)現(xiàn)在胚胎中的組織特異性表達(dá)。日益強(qiáng)大且完善的基因編輯技術(shù)，尤其是 CRISPR/cas9 技術(shù)的出現(xiàn)，使得在斑馬魚基因組上實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)敲除或編輯成為可能。
中國引入斑馬魚研究是在 20 世紀(jì) 90 年代，到了 2000 年，斑馬魚在國內(nèi)已被廣泛應(yīng)用于早期胚胎發(fā)育研究，且一度成為斑馬魚研究增長的熱點(diǎn)，并逐漸在其他學(xué)科得到推廣。近年來，斑馬魚在國內(nèi)的應(yīng)用更多地偏重于生化與分子生物學(xué)，毒理學(xué)，環(huán)境科學(xué)和海洋淡水生物學(xué)等學(xué)科。相對而言，在神經(jīng)科學(xué)，發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)方面的研究群體需要得到進(jìn)一步的壯大(Xie et al., 2015)。
斑馬魚在科學(xué)界近 40 年的系統(tǒng)研究和應(yīng)用，產(chǎn)生了一大批優(yōu)質(zhì)的品系資源，包括野生品系，突變品系和轉(zhuǎn)基因品系。特異組織細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因品系，被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)和水產(chǎn)育種學(xué)等研究領(lǐng)域。
從 2000 年開始，斑馬魚轉(zhuǎn)基因模型在藥物篩選方面逐漸得到了較廣的應(yīng)用，斑馬魚體型小，產(chǎn)卵量大，其胚胎可以模擬體內(nèi)互作環(huán)境并可直接暴露于包含小分子化合物的溶液中，故可方便地使用96孔板同時進(jìn)行上千種小分子化合物的藥效篩選。斑馬魚胚胎在體外發(fā)育，發(fā)育快，早期是透明的，便于對胚胎發(fā)育過程中表型的改變進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，十分有利于開展高通量高內(nèi)涵的藥物篩選。通過胚胎的死亡率和孵化率的統(tǒng)計，胚胎發(fā)育過程中器官大小和形狀的改變監(jiān)測，心臟缺陷所致心率變化的監(jiān)測，行為學(xué)檢測和熒光標(biāo)記檢測等，來評估小分子化合物對機(jī)體功能的影響。
在血管生成和抗癌藥物篩選的工作中，應(yīng)用得較多的是一些血管特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系，還有一些是特定器官表達(dá)熒光的品系，可以用于跟蹤納米級藥物遞送系統(tǒng)，或者是測試藥物對器官的功效(Kessler et al.,2015)。比較熟知的一個應(yīng)用典范是 Tg (BMP4:EGFP)轉(zhuǎn)基因品系，其心肌細(xì)胞被綠色熒光標(biāo)記，該品系常被用于心臟毒性藥物的臨床前功能篩選(Lee et al., 2017)。結(jié)合先進(jìn)的成像工具，還可以使用斑馬魚跳動的心臟的假動力學(xué) 3D 圖像來分析藥物遞送后心臟功能的變化(Grunow et al., 2015)。對于其他的器官模型，這些方法同樣適用。
在組織再生研究方面，科學(xué)家利用斑馬魚模型獲得了一系列有特色的成果。目前已知的斑馬魚可以快速修復(fù)的器官有尾鰭，視網(wǎng)膜，肝臟，纖毛細(xì)胞，部分心臟和大腦等。斑馬魚胚胎的心臟在激光損傷后 24 小時后可以再生，并恢復(fù)心臟功能，再生能力十分驚人(Matrone et al., 2017)。科學(xué)家利用斑馬魚組織再生模型進(jìn)行藥物篩選時發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥成分丹參酮 IIa (Tanshinone IIa)在不影響中性粒細(xì)胞在損傷部位的聚集的情況下，可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡和反向轉(zhuǎn)移，從而有效減少炎癥的發(fā)生(Robertson et al., 2014)。
早期的自然突變品系的鑒定篩選，大規(guī)模 ENU 誘變，以及近年來大熱的基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)等，斑馬魚的突變品系資源日漸豐富。斑馬魚的基因組與人類基因組擁有較高的相似性，同為脊椎動物，發(fā)育模式有較高的相似性，人類疾病相關(guān)基因有82%可以在斑馬魚基因組上找到同源基因，故可利用斑馬魚構(gòu)建豐富的人類疾病模型。斑馬魚的基因組目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 26,000 多個蛋白編碼基因，這是已測序脊椎動物中數(shù)目最多的(Howeet al., 2013)。大約38%的蛋白編碼基因已經(jīng)通過各種突變方法和功能研究確定其在斑馬魚中的作用(Kettleborough et al., 2013)。在斑馬魚基因組中引入致癌基因或抑癌基因如 P53、APC、PTEN、BRAF 等的人類致病突變，就有可能得到類似癥狀的疾病模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行研究，可為人類疾病的發(fā)生機(jī)理和治療方案帶來新的曙光。目前的斑馬魚模型主要可以分為遺傳發(fā)育類疾病模型、癌癥模型、心血管與血液發(fā)生類模型、感染與免疫相關(guān)模型、肌肉與骨骼相關(guān)模型、組織再生類模型和神經(jīng)系統(tǒng)模型等。例如，黑色素瘤是皮膚癌的高致死原因之一，皮膚、粘膜或內(nèi)臟等器官中的黑色素細(xì)胞發(fā)生惡變，最常見的內(nèi)部誘因是癌基因 BRAF 基因的突變所致。在斑馬魚中引入人類致病突變 BRAF V600E，可引發(fā)黑色素瘤表型，在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物篩選，來氟米特(leflunomide)在 2000 多個藥物中脫穎而出，可以在一定程度上抑制黑色素瘤的發(fā)生(White etal.,2011)。斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中存在著大量與人類相似的信號傳導(dǎo)途徑，多種人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以在斑馬魚建立對應(yīng)的疾病模型，如斑馬魚中的獨(dú)眼針頭表型對應(yīng)人類的無腦癥，利用斑馬魚進(jìn)行研究確定是由CFC1 基因突變造成的(Bamford et al., 2000)。
3、斑馬魚標(biāo)準(zhǔn)化研究國家斑馬魚資源中心建設(shè)
實(shí)驗(yàn)動物資源是支撐國家科技創(chuàng)新與發(fā)展的基礎(chǔ)性，公益性的重要戰(zhàn)略生物資源。全球范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物資源建設(shè)的佼佼者是美國，美國 NIH 支持建立了國家級的實(shí)驗(yàn)動物資源保存和技術(shù)服務(wù)機(jī)構(gòu)，共有36個中心和資源庫，保存了 200 多個實(shí)驗(yàn)動物物種，占全球總物種的 60%。我國目前僅保存有 13 個物種的實(shí)驗(yàn)動物，從20 世紀(jì) 90 年代起，實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化被提上日程。實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化是資源建設(shè)的重要組成部分，是實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提條件，斑馬魚相關(guān)研究在國內(nèi)發(fā)展勢態(tài)良好，但目前斑馬魚僅有地方標(biāo)準(zhǔn)可以遵循。
CZRC 于 2012 年在中國科學(xué)院水生生物研究所成立，經(jīng)過 6 年時間的發(fā)展，成為國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的全球三 大斑馬魚資源庫之一。通過資源交換、引進(jìn)和自主創(chuàng)建等方式，CZRC 保存的斑馬魚品系超過 1400 個，其中有超過 200 個突變和轉(zhuǎn)基因品系是由 CZRC 自主創(chuàng)建。除了品系資源，CZRC 還保藏有 2000 多個 DNA 探針、150個質(zhì)粒、61 個斑馬魚抗體和 2 個斑馬魚細(xì)胞系等相關(guān)資源。所有的資源信息均可以在中心網(wǎng)站進(jìn)行查詢 （http://zfish.cn）。CZRC的建立在我國斑馬魚學(xué)界中架構(gòu)起良性溝通的渠道，有力地促進(jìn)斑馬魚品系資源的標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)資源的優(yōu)化配置和共享服務(wù)，為國家科技創(chuàng)新與發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)的資源和技術(shù)服務(wù)。我國的斑馬 魚的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化將主要從存量優(yōu)化，增量建設(shè)和共享服務(wù)這三個方面著手，旨在促進(jìn)斑馬魚在我國研究與應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步普及，和應(yīng)用的規(guī)范化。
3.1 存量優(yōu)化
國內(nèi)的斑馬魚研究正在高速發(fā)展階段，研究體量在逐年增加，由本世紀(jì)初的不足 2%迅速發(fā)展到 2017 年的23%，成為繼美國之后的第二大斑馬魚研究大國(Xie et al., 2015)。一方面，大量具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新品系和新資源在中國斑馬魚學(xué)界不斷產(chǎn)出，另一方面，科研工作者對相關(guān)研究資源、技術(shù)服務(wù)方面的需求也在不斷擴(kuò)大。斑馬魚品系的安全保藏和便利分享，必然即是領(lǐng)域內(nèi)研究者的迫切需求，CZRC作為中國唯一的國家級斑馬魚資源平臺，自然承擔(dān)起雙方面的工作，承接起中國斑馬魚學(xué)界溝通橋梁的重任。此外放眼全球，在國際斑馬魚研究領(lǐng)域，相關(guān)研究起步早，尤其是上世紀(jì) 90 年代在斑馬魚中啟動的大規(guī)模誘變篩選工作，研究人員已構(gòu)建了數(shù)萬種遺傳突變和轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，這些品系大部分都保存在美國的國際斑馬魚資源中心和德國的歐洲斑馬魚資源中心。這其中包含有眾多的重要的動物模型，但是目前活體動物進(jìn)出口程序十分復(fù)雜，獲取知識產(chǎn)權(quán)授權(quán)困難重重，故大多數(shù)品系都不能為國內(nèi)研究者所用。CZRC致力于為國內(nèi)研究者提供優(yōu)良斑馬魚相關(guān)資源，目前已經(jīng)和 ZIRC 建立正式合作，將有計劃地從 ZIRC 批量引進(jìn)斑馬魚品系(Xiong et al., 2018)。
經(jīng)過半個世紀(jì)的研究與發(fā)展，斑馬魚的生物學(xué)特性，如種群動態(tài)特征，遺傳檢測，種群性別比例變化規(guī)律，生長模式，生理生化指標(biāo)，繁殖啟動時間，腸道寄生生物指標(biāo)等已陸續(xù)測定。2015年，廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所、中國科學(xué)院水生生物研究所（國家斑馬魚資源中心）等單位開展合作，研制斑馬魚遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境、病原等質(zhì)量控制的國家標(biāo)準(zhǔn)。斑馬魚研究在我國日漸普及，制訂其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義，接下來我們將對斑馬魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容進(jìn)行簡要的介紹。
3.1.1 遺傳質(zhì)量控制
斑馬魚采取的是體外受精、體外發(fā)育的發(fā)育模式，繁殖用種魚必須遺傳背景明確，來源清楚，有較完整的資料（包括品系名稱、傳代代數(shù)、遺傳基因特點(diǎn)及主要生物學(xué)特征等）。
在 CZRC，野生型斑馬魚品系采用封閉群的傳代方式，至少使用 25 對及以上的親本種魚，這樣可以保證了生物特性的多樣性，保持封閉群動物的遺傳基因的穩(wěn)定，避免近親交配常出現(xiàn)的種質(zhì)退化現(xiàn)象。對于一般的實(shí)驗(yàn)室，建議引種種魚數(shù)不得少于 25 對，種魚應(yīng)來自于基礎(chǔ)封閉群。
CZRC 也曾針對兩種常用的斑馬魚野生品系，AB 和 TU，篩選并選取了 20 個微衛(wèi)星位點(diǎn)，應(yīng)用部分篩選的微衛(wèi)星位點(diǎn)成功地對這兩種品系進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。
3.1.2 病原學(xué)等級及監(jiān)測
針對斑馬魚的病原監(jiān)測不僅要監(jiān)測和消除養(yǎng)殖設(shè)備和水環(huán)境的潛在病原體，還有外來品系的隔離檢疫管理。監(jiān)測的重點(diǎn)主要有品系魚的來源，水環(huán)境的指標(biāo)，飼養(yǎng)管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，斑馬魚日常觀察等。對于已存在或潛在的魚病，應(yīng)及時處理，分離異常表現(xiàn)斑馬魚，隔離觀察、改善水環(huán)境指標(biāo)，詳細(xì)記錄異常情況及其變化情況。不管是非感染性或感染性疾病，均會對斑馬魚的健康造成危害，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是感染性疾病，常常可形成大面積的爆發(fā)性感染，需要嚴(yán)加防范。
按照病原，斑馬魚的主要感染性疾病可以分為病毒性疾病，細(xì)菌性疾病，真菌和藻類引起的疾病和原生動物引起的疾病。斑馬魚魚病應(yīng)以預(yù)防為主，關(guān)鍵在于日常標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的飼養(yǎng)管理和實(shí)驗(yàn)操作(Liu et al.,2016)。對于引進(jìn)的外來品系，采取隔離檢疫和消毒措施，引進(jìn)的活體先進(jìn)行健康檢查，隔離飼養(yǎng)期間（一般為2 周）相關(guān)檢查結(jié)果為陰性的品系，可進(jìn)行傳代并將胚胎消毒后轉(zhuǎn)移至主養(yǎng)殖系統(tǒng)中，用于生產(chǎn)和相關(guān)研究，盡量減少其攜帶和傳播病原的風(fēng)險。
日常管理中，應(yīng)制定良好的飼養(yǎng)操作與日常管理規(guī)范，減少魚病的發(fā)生，保證培育工作的順利進(jìn)行，杜絕種質(zhì)污染。排除常見的人類共患病病原，以保障實(shí)驗(yàn)動物管理和實(shí)驗(yàn)人員的健康與安全。排除對魚類危害大的病原，以保障斑馬魚培育工作和實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行。排除對實(shí)驗(yàn)結(jié)果具潛在干擾的主要病原如支原體等，以確保動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
3.1.3 飼料
不同發(fā)育時期的幼魚或成魚應(yīng)根據(jù)其自身特點(diǎn)選擇合適口徑的活體或顆粒餌料進(jìn)行投喂。幼魚早期的喂養(yǎng)與管理方式對成活率有重大影響。剛孵出的幼魚口裂小，喜好攝食活餌，開口餌料一般可選用草履蟲、輪蟲、人工飼料等小口徑餌料。人工飼料不便于水質(zhì)管理，輪蟲等活餌容易寄生病原體，故最常用的是草履蟲。
半月齡左右的幼魚可以開始攝食鹵蟲幼蟲或大口徑顆粒飼料。活體餌料與顆粒餌料相比，由于幼魚的視覺系統(tǒng)與消化系統(tǒng)逐步發(fā)育的緣故，前者營養(yǎng)全面，適口性高，可大幅提高幼魚的存活率，如果能同時輔以顆粒飼料，補(bǔ)充蛋白質(zhì)、脂肪、糖、無機(jī)鹽和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，可以進(jìn)一步提高幼魚的存活率。
3.1.4 環(huán)境條件
環(huán)境條件最重要的內(nèi)容之一就是養(yǎng)殖水環(huán)境的水質(zhì)控制，水質(zhì)因素主要有水溫、溶解氧、非離子氨、亞硝酸態(tài)氮、pH、硬度等，其中水溫、溶解氧、氨氮值等與養(yǎng)殖過程管理關(guān)系較大。斑馬魚的最適生長溫度是 28.5℃，在20℃～28℃溫度區(qū)間可以正常生長，溫度過低或過高都容易生病或出現(xiàn)死亡。溶解氧是魚類賴以生存的必要條件，直接影響呼吸，間接影響魚類的攝食和消化活動而影響生長發(fā)育。通過空氣壓縮機(jī)使空氣中的氧氣溶解于水中或采取循環(huán)水體來增加溶氧量，都可以在一定程度上加速了水中有機(jī)物質(zhì)的分解，有利于水質(zhì)改善。氨氮主要來源于魚類的排泄物和食物殘渣等含氮有機(jī)物的分解作用，對魚類有害，可對其鰓部表皮細(xì)胞造成損害，嚴(yán)重的會使其喪失免疫力，引發(fā)感染。養(yǎng)殖水體需要及時排污，可有效降低氨氮值。水質(zhì)控制最重要的就是做好循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的日常管理。
其次是設(shè)施環(huán)境，循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的材質(zhì)和設(shè)備陳設(shè)安排等都應(yīng)按斑馬魚的體型和生活習(xí)性而盡量優(yōu)化。設(shè)施所處空間要求光線充足，通風(fēng)良好，排污排水設(shè)施齊全，配備照明設(shè)備和加溫系統(tǒng)，配備增氧和過濾系統(tǒng)。主要的水質(zhì)參數(shù)應(yīng)配備相應(yīng)的探頭進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，強(qiáng)大而有效率的配套設(shè)施是水質(zhì)穩(wěn)定的重要支持。 CZRC在綜合考慮所有因素，參考了國際和國內(nèi)的斑馬魚研究同行的平臺，建立了安全規(guī)范的斑馬魚養(yǎng)殖和健康平臺，并在此基礎(chǔ)上，建立了高效的基因操作平臺和穩(wěn)定高效的精子凍存平臺。CZRC 占地600平米，由一流標(biāo)準(zhǔn)的斑馬魚資源保藏區(qū)和遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室組成。其中，資源保藏區(qū)包括主魚房、外來魚隔離房、育苗室、顯微注射室和精子超低溫保藏室等功能區(qū)域。主養(yǎng)魚房面積為 350 平米，最大養(yǎng)殖容量超過 20 萬尾成年斑馬魚(Li KY, 2014)。在已保存的1400多種斑馬魚品系中，有約400種以活體形式養(yǎng)殖在魚房內(nèi)，有1200多種已通過超低溫精子凍存的方式進(jìn)行保藏。2015 年著手建立斑馬魚精子凍存庫系統(tǒng)，配備有 2 個大型液氮儲藏罐，可容納 5 萬管以上的精子凍存樣本，現(xiàn)有凍存精子樣品超過10000管，平均復(fù)蘇受精率54%，最好的紀(jì)錄超過90%，精子樣品復(fù)蘇受精率達(dá)到全球最佳水平。
CZRC 的斑馬魚品系資源主要來源依次為收集整理國內(nèi)學(xué)者創(chuàng)制的斑馬魚品系，CZRC 自主創(chuàng)制斑馬魚品系，以及由海外實(shí)驗(yàn)室和資源中心引進(jìn)。這三種來源的斑馬魚品系占全部保藏資源的比例依次為 55%，30%和 15%，整體上超過80%的品系資源是由中國的斑馬魚實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立創(chuàng)制后提交保藏，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，在全球范圍內(nèi)為 CZRC 所獨(dú)有。2018 年，我國斑馬魚研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)室已超過 500 家，為了有效收集這些實(shí)驗(yàn)室自主創(chuàng)制的斑馬魚相關(guān)資源，CZRC每年都會對集中調(diào)研中國斑馬魚學(xué)界的論文發(fā)表情況，收集已發(fā)表論文的斑馬魚相關(guān)新資源的信息，力求爭取整合這些新資源到 CZRC，并在斑馬魚研究領(lǐng)域共享。
3.2 增量建設(shè)
在斑馬魚品系資源增量建設(shè)的道路上，我們要重視掌握和研究最新的斑馬魚品系開發(fā)技術(shù)，積極創(chuàng)制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新品系資源，尤其是可以作為疾病模型和研究新工具的基因突變品系和轉(zhuǎn)基因品系。 在國際上，最大規(guī)模的斑馬魚品系和基因資源集中儲備在位于美國俄勒岡大學(xué)的國際斑馬魚資源中心（Zebrafish International Resource Center，簡稱 ZIRC），由于接管了歐美數(shù)家研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行的大規(guī)模基因組誘變項(xiàng)目的成果，其保藏斑馬魚品系數(shù)量已超過 3 萬種。與之相類似，位于德國的歐洲斑馬魚資源中心（European Zebrafish Resource Center，簡稱 EZRC）也已保藏各類斑馬魚品系 2 萬多種。CZRC 保藏的斑馬魚品系資源在短短 6 年時間里從 200 多種增加到 1400 多種也主要得益于 2013 年啟動的斑馬魚 1 號染色體全基因敲除計劃（簡稱 ZKO 計劃）。ZKO 計劃由中國科學(xué)院水生生物研究所、北京大學(xué)和清華大學(xué)等單位的 38 家實(shí)驗(yàn)室共同參與，歷時近 3 年，本項(xiàng)目共計構(gòu)建特異性的斑馬魚突變品系 714 個，全部品系信息都在 CZRC 網(wǎng)站和國際斑馬魚信息中心數(shù)據(jù)庫公開。項(xiàng)目產(chǎn)生品系全部保藏在 CZRC 斑馬魚精子凍存庫中，并對國內(nèi)外學(xué)術(shù)界公開(http://www.zfish. cn/TargetList.aspx)。這是我國斑馬魚學(xué)界第一次進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)誘變篩選，項(xiàng)目的進(jìn)展和成果已取得了全球性的關(guān)注和影響力。
CZRC 在發(fā)展初期建立了基于 TALEN 技術(shù)的基因敲除平臺和基于CRISPR/Cas9 技術(shù)的基因敲除平臺，以及基于Tol2的轉(zhuǎn)基因操作平臺。隨后結(jié)合斑馬魚原始生殖細(xì)胞操作技術(shù)，分別建立了高效、特異的斑馬魚原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)基因操作平臺和基于CRISPR/Cas9技術(shù)的斑馬魚原始生殖細(xì)胞基因敲除平臺。這兩個平臺中，外源DNA 或 mRNA 偏好作用于生殖細(xì)胞，整合外源基因或被打靶編輯，故可相對更快速地篩選出具有可遺傳性狀的子代。截止目前，CZRC 利用基因組編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功地自主創(chuàng)制了超過 200 個基因突變品系和轉(zhuǎn)基因品系。CZRC 將持續(xù)為各個領(lǐng)域的研究者提供特異性品系構(gòu)建服務(wù)，在未來 2 年，CZRC將進(jìn)一步創(chuàng)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的人類疾病模型，并建設(shè)高通量斑馬魚藥物篩選平臺。建成后，該平臺將可服務(wù)于環(huán)境監(jiān)測、藥物藥效評估、新藥篩選和各種斑馬魚行為學(xué)研究的科研和應(yīng)用領(lǐng)域。
3.3 共享服務(wù)
斑馬魚品系資源的持續(xù)擴(kuò)容優(yōu)化和便于分享，將極大地促進(jìn)中國斑馬魚研究的深化發(fā)展，CZRC在中國斑馬魚學(xué)界負(fù)責(zé)起品系收集和共享，信息溝通的重任。相比于美國的 ZIRC 和歐洲的 EZRC 兩大斑馬魚資源平臺，CZRC具有特殊的技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢，除了為國內(nèi)外用戶提供標(biāo)準(zhǔn)的斑馬魚品系資源，還可以為斑馬魚研究者提供 品系構(gòu)建、技術(shù)培訓(xùn)、信息共享、科研及技術(shù)咨詢等方面的服務(wù)，促進(jìn)了斑馬魚相關(guān)養(yǎng)殖和研究新技術(shù)等在國內(nèi)斑馬魚學(xué)界的信息共享。
CZRC 自成立以來為全國29個省區(qū)市180多家機(jī)構(gòu)提供各類斑馬魚相關(guān)資源服務(wù)800多批次。此外，為日本、韓國、美國、德國和瑞士等國家的16家機(jī)構(gòu)提供資源26批次。提供的品系要求符合實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)，遺傳背景清晰，資料信息齊全。品系資源運(yùn)輸也是嚴(yán)格遵照活體運(yùn)輸規(guī)范執(zhí)行，保證容器的安全，保持水溫的 相對恒定，控制容器的氧氣含量，選擇最快捷的運(yùn)輸方式，以確保活體品系的健康安全送達(dá)。CZRC的服務(wù)獲得了國內(nèi)外研究同行的高度認(rèn)可，截至目前，由 CZRC 提供品系資源所發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)累計已超過 140 篇。
CZRC提供的技術(shù)服務(wù)主要包括構(gòu)建特異性轉(zhuǎn)基因及基因敲除品系、舉辦全國性斑馬魚技術(shù)培訓(xùn)班、斑馬魚養(yǎng)殖技術(shù)咨詢、斑馬魚魚病咨詢等。2013 年以來總共提供品系構(gòu)建服務(wù) 40 余次，構(gòu)建了 70多個特異性轉(zhuǎn)基因或基因突變品系，為一線科研課題提供了有力的技術(shù)支撐。技術(shù)培訓(xùn)班采用采用理論課與實(shí)驗(yàn)課相結(jié)合的 方式，現(xiàn)已舉辦 8 期，參訓(xùn)學(xué)員 200 多人次，培訓(xùn)專題包括斑馬魚魚房建設(shè)和健康養(yǎng)殖、原位雜交、顯微注射、精子凍存和基因組編輯技術(shù)等斑馬魚實(shí)驗(yàn)技術(shù)。CZRC從建立開始即努力為斑馬魚相關(guān)科研人員提供斑馬 魚養(yǎng)殖健康和魚病等咨詢服務(wù)，介紹科學(xué)的養(yǎng)殖參數(shù)和養(yǎng)殖要點(diǎn)，及常見魚病預(yù)防和處理措施等。CZRC希望通過這種咨詢服務(wù)可以在一定程度上提高魚房管理人員的科學(xué)養(yǎng)殖技術(shù)水平，加強(qiáng)國內(nèi)斑馬魚魚房的健康發(fā)展。
除此之外，CZRC在學(xué)術(shù)服務(wù)方面也做了很多努力。每兩年舉辦“中國斑馬魚 PI 大會”，成為領(lǐng)域內(nèi)資深科學(xué)家交流的重要平臺。2016 年 9 月，CZRC參與籌建的中國動物學(xué)會斑馬魚分會正式成立, 學(xué)會將依據(jù)斑馬 魚的學(xué)科特點(diǎn)和國際發(fā)展趨勢，開展相關(guān)工作。從 2017 年開始建設(shè)“中國斑馬魚信息中心”平臺（www.zfin.cn）。
該平臺將涵蓋中國斑馬魚學(xué)會網(wǎng)站、學(xué)界信息人員交流平臺、斑馬魚品系資源管理和資源共享等方面的功能。 CZRC力求能為中國斑馬魚研究領(lǐng)域各類資源信息保藏、交流和共享提供有力的支持。
CZRC將利用自身優(yōu)勢，持續(xù)擴(kuò)大斑馬魚相關(guān)資源的收集、保藏和分享規(guī)模。首先 CZRC 擁有全球最佳水平的斑馬魚精子凍存保藏系統(tǒng)，可利用此系統(tǒng)為全國的斑馬魚學(xué)界提供品系凍存支持并同時收集我國研究者創(chuàng)制 的品系資源。其次，CZRC有全國最豐富的斑馬魚基因編輯及轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，不僅可為各個領(lǐng)域的研究者提 供特異性品系構(gòu)建服務(wù)，還將持續(xù)自主創(chuàng)制服務(wù)于最新科研方向的各類斑馬魚品系及模型。第三，CZRC正在 建設(shè)的“中國斑馬魚信息中心”系統(tǒng)，將不僅實(shí)現(xiàn)更便捷的網(wǎng)上資源服務(wù)流程，同時還將為中國的斑馬魚學(xué)界 提供學(xué)科內(nèi)資訊、人員情況、科研交流及斑馬魚品系管理方面的網(wǎng)絡(luò)共享服務(wù)。
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